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具有抗龋齿功能的组合物的制作方法
来自 : www.xjishu.com/zhuanli/05/0280
发布时间：2021-03-24
专利名称：具有抗龋齿功能的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有抗龋齿功能的膳食组合物和口腔组合物。更具体地，本发明涉及具有抗龋齿功能的膳食组合物和口腔组合物，例如给牙齿补充矿质以减小龋齿的发生。
背景技术：
龋齿是一种由口腔中存在于牙齿表面的细菌引起的牙齿表面的脱矿质。具体地说，由于一些障碍使口腔细菌产生的有机酸不能扩散，牙齿暴露于高浓度的有机酸，因此牙齿表面被脱矿质。在此定义中，任何具有通过代谢发酵糖产生有机酸的能力的口腔细菌都能引起龋齿。适合有机酸生产的底物是糖类，包括单糖和寡糖(例如，葡萄糖和蔗糖)，和单糖的聚合物多糖(如淀粉)。
一般说来，有机酸不能分散归因于(1)从饮食中摄取的淀粉在牙颈和牙根上滞留，和(2)不溶解的葡聚糖粘附在牙齿上，这是使用易于降解的糖，例如蔗糖(即发酵的糖)作为底物由细菌产生的。
对于因素(1)，认为任何具有发酵糖能力的口腔细菌，例如乳酸杆菌是造成龋齿的原因。在这种情况下，已知龋齿的进展通常是缓慢的。产生高浓度有机酸的环境的发展取决于被动因素。
在含蔗糖的食物可广泛得到的今天，因素(2)是龋齿的主要原因。在这种情况下，认为变异链球菌(Streptococcus mutans)和表兄链球菌(s.sobrinus)是引起龋齿的原因。这两种细菌都是以链型发生的链球菌的一个类型，每个细胞具有约0.6μm直径的圆形。在蔗糖存在下，这两种细菌活跃地产生不溶于水的α-葡聚糖。该葡聚糖具有很好粘附于牙齿表面的特性。细菌迅速代谢蔗糖，发挥产生酸的能力。该细菌本身具有强的抗酸性并可在其它细菌不能生长的酸性环境中存活。不溶于水的葡聚糖的粘附性使细菌牢固地粘附于牙齿表面等地方。不溶于水的葡聚糖吸附于牙齿表面，使由细菌产生的有机酸不能扩散，导致牙齿表面暴露于高浓度有机酸的环境中。认为与因素(1)相比，产生高浓度有机酸的环境的形成取决于细菌的活性因素。在这种情况下，龋齿的发展比因素(1)引起的较快。
有一个新的方法通过在微观水平上考虑牙齿的健康来预防龋齿，即牙质的脱矿质和补充矿质(Yoichi Iijima，Takashi Kumagaya；Kariesu Kontororu Dakkai-toSaisekkaike-no-Mekanizumu[龋齿控制-脱矿质和补充矿质的机制(Caries Control-Mechanism of Demineralization and Remineralization)]，Ishiyaku Shuppan K.K.；21-51，1999)。牙齿表面是由钙和磷酸盐晶体羟磷灰石[Ca10(PO4)6(OH)2]制成的，并称为釉质。釉质是牙齿最坚硬的部分，并防止由于齿斑中的细菌产生的有机酸、食物中所含的酸等造成的釉质下的重要的钙或磷酸盐溶解(脱矿质)。
有机酸通过充满水的釉柱之间的间隙渗透釉质，并通过称为脱矿质的过程溶解羟磷灰石。钙和磷酸盐从釉质组织中损失导致釉质表层下最初的龋齿的发生。如下文所描述的，根据本发明，上述阶段的龋齿可以修复。钙和磷酸盐离子透过釉质表面下的龋齿部分及磷灰石的损失可通过称为补充矿质的过程恢复。
每当摄入含有发酵的碳水化合物的食物，齿斑的pH变为酸性并超过临界pH，脱矿质开始。这是由于齿斑中产生酸的细菌的作用。当齿斑被唾液缓冲时，齿斑的pH恢复中性，唾液中的钙和磷酸盐离子再通过齿斑进入牙质(这一过程被称为补充矿质)。
因此，预防和治疗龋齿的方法不应是引起龋齿使细菌产生有机酸的口腔细菌的营养物；不应是引起龋齿使细菌产生不溶于水的葡聚糖和有机酸的变异链球菌的营养物；应防止由于有机酸pH下降至脱矿质开始的pH以下(例如，应具有缓冲能力以防止pH下降)；应促进补充矿质等等。
迄今为止已知各种抗龋齿的药剂。
当使用蔗糖作为营养物和糖基转移酶作为酶变异链球菌产生不溶于水的葡聚糖时龋齿开始。此葡聚糖覆盖在牙齿表面，产生齿斑。当变异链球菌在齿斑内进行酸发酵时，牙齿被溶解掉并形成牙脱落。
关于抗龋齿的糖类，已提出一些不是变异链球菌的营养物的寡糖(S.Hamada等，J.Jpn.Soc.Starch Sci.，31卷，83-91页，1984)。这些抗龋齿的糖类的一个例子是palatinit(日本公开出版物2000-281550号)。当palatinit与氟或锌结合，促进牙齿的补充矿质。(日本公开出版物2000-247852号)。但是，palatinit的甜味差且不适合于食物。而且，对于palatinit补充矿质的效果需要高达约1-20wt％的浓度。
还已知糖醇(具体是木糖醇)是一种抗龋齿的药剂(例如，日本公开出版物2000-128752号和日本公开出版物2000-53549号)。日本公开出版物11-12143号公开了一种包含选自木糖醇、甘露醇、半乳糖醇和肌醇的一种或多种糖醇的口腔组合物。日本公开出版物11-12143号描述这些糖醇可促进牙齿补充矿质，但不抑制细菌的生长。虽然糖醇只在高浓度时有效，已知大量摄取糖醇引起稀粪。如下文实施例中所描述的，实质上没有证实木糖醇的效果。
另外，已报道和利用茶叶的一种成分多酚作为抗龋齿的药剂(S.Sakanaka等，Fragrance Journal，11卷，42-49页，1990)。但是，多酚的使用也引起味觉的问题并因此受到限制。
目前，据说氟对于补充矿质的作用是最有效的。氟可在约2ppm时发挥足够的效力。关于氟的效力，已澄清了以下两点(1)促进补充矿质；和(2)氟掺入羟磷灰石晶体，接着羟磷灰石晶体转化成抗脱矿质的坚硬的晶体结构(使用氟是期望效果(2)而不是(1))。最近，具有这种特性的氟已加入各种口腔组合物中。例如，日本公开出版物11-130643号公开了一种含有碳酸钙和可溶性氟化物的口腔组合物。已知氟化物离子和糖醇的结合增强氟补充牙齿矿质的能力(例如，日本公开出版物11-21217号，日本公开出版物2000-72638号，和日本公开出版物2000-154127号)。日本公开出版物8-12541号公开了一种含有变异酶(mutanase)和氟化物的组合物，它增强牙质并促进补充矿质而有效地防止龋齿。
本领域已知磷酸钙的供给促进牙齿补充矿质(例如，日本公开出版物11-228369号和日本公开出版物10-310513号)。
日本公开出版物11-29454号公开了一种含有碳酸钙和藻酸盐的口腔组合物。该组合物增强碳酸钙附着和保留在牙齿上的能力，因此获得令人满意的pH的中和及促进矿质的补充，产生极好的预防龋齿的效果。
日本公开出版物8-104696号描述了其中公开的磷酸化寡糖抑制钙和磷的沉淀和结晶(即钙化作用)，磷酸化寡糖不是引起龋齿的变异链球菌的营养物，因此不产生不溶于水的葡聚糖，并且磷酸化寡糖具有缓冲能力并具有防止pH下降的作用。上文描述的特性防止龋齿和齿斑的发生以及由变异链球菌引起的酸发酵。它还公开了包含于一种膳食组合物或口腔组合物中的磷酸化寡糖具有防止由于乳酸造成的pH下降的作用，乳酸是齿斑内发酵的产物，而对香味没有影响。然而，日本公开出版物8-104696号没有提示上述磷酸化寡糖能够如本文所描述的在低浓度时具有补充矿质的作用。
本
发明内容
因此，本发明涉及具有抗龋齿功能的物质。具体地说，本发明的目的是提供膳食组合物和口腔组合物，这些组合物通过牙齿补充矿质等减少龋齿的发生。
发明者通过使用各种物质精密地研究了预防龋齿的技术。结果，发明者发现了一种对牙齿具有补充矿质作用的缓冲剂，并完成了本发明。
根据本发明的一个方面，一种膳食组合物具有抗龋齿功能。该组合物包含一种在口腔内具有pH缓冲作用的缓冲剂。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂是磷酸化寡糖或其糖醇。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂选自磷酸化寡糖或其糖醇，其中中磷酸化寡糖是由具有α-1，4键的3-5个葡萄糖组成的葡聚糖，其中一个磷酸基团与葡聚糖连接，或者由具有α-1，4键的2-8个葡萄糖组成的葡聚糖，其中两个磷酸基团与葡聚糖连接；硫酸软骨素；硫酸软骨素寡糖；葡萄糖-6-磷酸；寡半乳糖醛酸；和酒石酸。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂是磷酸化寡糖或其糖醇。该磷酸化寡糖是由具有α-1，4键的3-5个葡萄糖组成的葡聚糖，其中一个磷酸基团与葡聚糖连接，或者是由具有α-1，4键的2-8个葡萄糖组成的葡聚糖，其中两个磷酸基团与葡聚糖连接。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂是以碱性金属盐、碱土金属盐和铁盐的形式存在。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂是以钠盐或钙盐的形式存在。
在本发明的一个实施例中，该膳食组合物进一步包含有效量的氟或含有抗龋齿的物质的氟。
根据本发明的另一个方面，一种膳食组合物具有抗龋齿的功能。该组合物包括一种在口腔中具有pH缓冲作用的缓冲剂，一种磷-钙补偿剂，一种磷制剂，和/或一种钙制剂。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂是磷酸化寡糖或其糖醇。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂选自磷酸化寡糖或其糖醇，其中磷酸化寡糖是由具有α-1，4键的3-5个葡萄糖组成的葡聚糖，其中一个磷酸基团与葡聚糖连接，或者由具有α-1，4键的2-8个葡萄糖组成的葡聚糖，其中两个磷酸基团与葡聚糖连接；硫酸软骨素；硫酸软骨素寡糖；葡萄糖-6-磷酸；寡半乳糖醛酸；和酒石酸。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂是磷酸化寡糖或其糖醇。该磷酸化寡糖是由具有α-1，4键的3-5个葡萄糖组成的葡聚糖，其中一个磷酸基团与葡聚糖连接，或者是由具有α-1，4键的2-8个葡萄糖组成的葡聚糖，其中两个磷酸基团与葡聚糖连接。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂是以碱性金属盐、碱土金属盐和铁盐的形式存在。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂是以钠盐或钙盐的形式存在。
在本发明的一个实施例中，该膳食组合物进一步包含有效量的氟或含有抗龋齿的物质的氟。
根据本发明的另一个方面，一种口腔组合物具有抗龋齿的功能。该组合物包含在口腔中具有pH缓冲作用的缓冲剂。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂是磷酸化寡糖或其糖醇。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂选自磷酸化寡糖或其糖醇，其中磷酸化寡糖是由具有α-1，4键的3-5个葡萄糖组成的葡聚糖，其中一个磷酸基团与葡聚糖连接，或者由具有α-1，4键的2-8个葡萄糖组成的葡聚糖，其中两个磷酸基团与葡聚糖连接；硫酸软骨素；硫酸软骨素寡糖；葡萄糖-6-磷酸；寡半乳糖醛酸；和酒石酸。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂是磷酸化寡糖或其糖醇。该磷酸化寡糖是由具有α-1，4键的3-5个葡萄糖组成的葡聚糖，其中一个磷酸基团与葡聚糖连接，或者是由具有α-1，4键的2-8个葡萄糖组成的葡聚糖，其中两个磷酸基团与葡聚糖连接。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂是以碱性金属盐、碱土金属盐，锌盐和铁盐的形式存在。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂是以钠盐、钙盐或锌盐的形式存在。
在本发明的一个实施例中，该口腔组合物进一步包含有效量的氟或含有抗龋齿的物质的氟。
根据本发明的另一个方面，一种口腔组合物具有抗龋齿的功能。该组合物包含一种在口腔中具有pH缓冲作用的缓冲剂，一种磷-钙补偿剂，一种磷制剂，和/或一种钙制剂。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂是磷酸化寡糖或其糖醇。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂选自磷酸化寡糖或其糖醇，其中磷酸化寡糖是由具有α-1，4键的3-5个葡萄糖组成的葡聚糖，其中一个磷酸基团与葡聚糖连接，或者由具有α-1，4键的2-8个葡萄糖组成的葡聚糖，其中两个磷酸基团与葡聚糖连接；硫酸软骨素；硫酸软骨素寡糖；葡萄糖-6-磷酸；寡半乳糖醛酸；和酒石酸。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂是磷酸化寡糖或其糖醇。该磷酸化寡糖是由具有α-1，4键的3-5个葡萄糖组成的葡聚糖，其中一个磷酸基团与葡聚糖连接，或者是由具有α-1，4键的2-8个葡萄糖组成的葡聚糖，其中两个磷酸基团与葡聚糖连接。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂是以碱性金属盐、碱土金属盐，锌盐或铁盐的形式存在。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂是以钠盐、钙盐或锌盐的形式存在。
在本发明的一个实施例中，该口腔组合物进一步包含有效量的氟或含有抗龋齿的物质的氟。
根据本发明的另一个方面，一种用于研究预期对牙齿具有抗龋齿作用的样品的补充矿质效果的方法，该方法包括步骤(A)在有样品的情况下，使含有磷、钙和牙齿成分的溶液进行钙沉淀反应；(B)沉淀反应后，测定溶液中钙的浓度或沉淀的钙的数量；(C)使不含有样品的溶液进行钙沉淀反应；(D)沉淀反应后，测定溶液中钙的浓度或沉淀的钙的数量；和(E)比较在步骤(B)和(D)中溶液中钙的浓度或沉淀的钙的数量。
在本发明的一个实施例中，该溶液含有羟磷灰石、缓冲液、KH2PO4和CaCl2。
附图简述
图1是显示使用牛的牙齿切片在补充矿质的试验系统中由于龋齿导致矿物质流失值的图。
图2是显示使用牛的牙切片在补充矿质的试验系统中损伤深度的图。
图3是显示在实施例4中一个简单的试验系统中使用磷酸化寡糖钠盐补充矿质的结果的图。
图4是显示在实施例4中一个简单的试验系统中使用磷酸化寡糖钙盐补充矿质的结果的图。
图5是显示当P/Ca为0.6时，磷酸化寡糖对补充矿质的影响的图。
图6A是显示在没有磷酸化寡糖的情况下，P/Ca浓度比的变化对补充矿质的影响的图。图6B是显示在有磷酸化寡糖钠盐的情况下，P/Ca浓度比的变化对补充矿质的影响的图。图6C是显示在有磷酸化寡糖钙盐的情况下，P/Ca浓度比的变化对补充矿质的影响的图。
图7A是显示在实施例5中磷酸化寡糖钙盐和磷酸化寡糖钠盐补充矿质的作用的图。图7B是显示木糖醇和木糖补充矿质作用的图。图7C是显示palatinit和异蔗糖(palatinose)的补充矿质作用的图。
图8是显示实施例7中TLC分析结果的照片。
图9是显示实施例7中磷酸化寡糖和氟对补充矿质的协同作用的图。
图10是显示实施例8中具有标准溶液浓度的磷酸化寡糖的TLC分析结果的照片。
图11是显示TLC分析结果的照片，该结果说明在实施例8中当食用含有口香糖的磷酸化寡糖时，随时间洗提的量。
图12是显示实施例12中各种物质的补充矿质的效果的图。
图13是显示实施例13中各种物质的补充矿质的效果的图。
图14是显示实施例14中一个人工口服装置中的pH变化的图。
图15是显示实施例16中当咀嚼含有POs Ca的口香糖或不含POs Ca的口香糖时唾液的量的图。
图16是显示实施例16中当咀嚼含有POs Ca的口香糖或不含POs Ca的口香糖时唾液的pH的图。
图17是显示实施例16中当咀嚼含有POs Ca的口香糖或不含POs Ca的口香糖时唾液的P含量的图。
图18是显示实施例16中当咀嚼含有POs Ca的口香糖或不含POs Ca的口香糖时唾液的Ca含量的图。
图19是显示实施例16中当咀嚼含有POs Ca的口香糖或不含POs Ca的口香糖时Ca/P比的变化的图。
图20A是显示实施例16中在每一个处理的牙齿中损伤深度的图。图20B是显示实施例16中在每一个处理的牙齿中矿物质流失值的图。
图21是显示实施例17中补充矿质比率的图。
图22是显示实施例18中当食用含有POs Ca的糖果时分泌的唾液的pH的图。
图23是显示实施例18中当食用含有POs Ca的冰糖时分泌的唾液的量的图。
图24是显示实施例18中当食用含有POs Ca的糖果时分泌的唾液的Ca和P含量的图。
图25是显示利用含有POs Ca的糖果和含有POs Ca的软糖补充矿质的试验结果的图。
图26是显示有代表性的磷酸化寡糖的化学结构式的图。
实施本发明的最佳模式下文中将更详细地描述本发明。
本文使用的术语“抗龋齿功能”是指预防龋齿和治疗龋齿的功能。治疗龋齿的功能是指修复曾经由于龋齿而损失的牙齿的部分的功能。本文使用的术语“抗龋齿功能”是指一个或多个如下特性(1)防止由于口腔细菌产生的酸造成的pH下降的pH缓冲能力；(2)防止口腔细菌产生不可溶的葡聚糖的能力；和(3)在龋齿的早期促进牙齿补充矿质的能力。较佳地，该抗龋齿功能具有两个上述特性，最佳地具有全部的上述特性。
本发明的组合物可稳定地对腐蚀的牙齿提供磷酸盐和钙。提供了磷酸盐和钙的牙齿被补充矿质，因此由于龋齿损失的牙齿部分可被修复。
根据本发明，一种缓冲剂加入到口腔中，因此在牙齿补充矿质中稳定地使用存在于口腔的唾液等中的磷酸盐和钙。因此，可以实现常规认为很难或不可能的牙齿的修复。
如果在适当的条件下，将钙或磷酸盐提供给脱矿质的釉质部分(补充矿质)，可修复脱矿质损伤达到完好状态。为了保持牙齿的完好状态，需要通过唾液提供矿物质给脱矿质的损伤，以便在微观水平上平衡脱矿质和补充矿质。通常，在吃或喝东西后齿斑中的pH往往降低，脱矿质和补充矿质之间的平衡被改变。当脱矿质＞补充矿质时，损伤发生。相反，当补充矿质＞脱矿质时，由于牙齿的补充矿质，脱矿质的损伤被修复。脱矿质和补充矿质之间的平衡很大程度上取决于口腔环境(具体地说，唾液和齿斑中的pH，钙和磷酸盐的浓度)。本发明提供一种补充矿质似乎可以发生的口腔环境，从而预防龋齿和治疗脱矿质损伤(龋齿的早期阶段)以获得健康而坚固的牙齿。
本文使用的术语“缓冲剂”是指在口腔中显示pH缓冲作用的试剂。具体地说，该缓冲剂是一种从例如缓冲剂的阴离子和阳离子获得的水溶性盐。口腔中缓冲剂的存在可稳定口腔中的pH。该缓冲剂稳定唾液中的磷酸盐离子和钙离子。因此，具体地说，优选一种在有磷酸盐离子和钙离子的情况下具有良好的pH缓冲作用的试剂。更优选地，当缓冲剂添加到含有磷酸盐离子和钙离子的水溶液中，磷酸盐离子和钙离子的稳定性不被缓冲剂所抑制。换句话说，似乎可与磷酸盐离子和钙离子起反应并形成沉淀的缓冲剂是不可取的。
此外，在本发明中，较佳地在齿斑中获得pH缓冲效果。如果在唾液中显示pH缓冲作用，那么pH的缓冲作用典型地显示于齿斑中。因此，在唾液中显示pH缓冲作用的缓冲剂可用于显示齿斑中的pH缓冲作用。一个氢离子敏感场效应晶体管电极(PH-6010由Nihon Kohden公司生产)可放置在一个釉质切片上并掺入下颌的部分托牙的牙齿间隙部分。此后，在电极敏感部分上形成的齿斑中的pH可根据YoshizumiTamasawa等(日本牙齿修复协会学报Journal of the Japan Prosthodontic Society，40卷特刊，147页，1996)，Kazuhiko Abe(DENTAL OUTLOOK，90(3)，650-654，1997)，Takahashi-Abbe，S等(Oral Microbiol.Immunol.，16，94-99页，2001)中描述的方法测定。齿斑中的pH较佳是6或更多，更佳是7或更多。当由于缓冲作用引起齿斑中的pH恢复到中性时，存在于口腔唾液中的磷酸盐离子和钙离子供应给牙齿表面，导致牙质补充矿质。齿斑中pH的上限没有具体限制，但是对于一个实际的生物体不想要一个高的碱性条件。齿斑中的pH较佳是10或更少，更佳是8或更少。
缓冲剂典型地以盐的形式使用，可任选地以游离酸的形式使用。即使缓冲剂在口腔中以游离酸的形式给予，由于可与游离酸一起形成盐的碱性金属等存在于口腔中，基本上可以说游离酸的盐提供给口腔。
可用于本发明的较佳的缓冲剂可通过简单的试验容易地选择。具体地说，各种已知的pH缓冲剂加入含有磷酸盐离子和钙离子的中性水溶液中(例如pH 6-8的水溶液)。观察沉淀的出现或不出现。在这种试验中没有形成沉淀的pH缓冲剂可满意地用作加入到本发明抗龋齿组合物中的缓冲剂。
当缓冲剂不存在时，由于口腔细菌产生的有机酸的作用口腔可被酸性化(即唾液或齿斑变为酸性)。当唾液或齿斑被酸性化时，牙齿的钙和磷作为Ca和P离子被洗脱，引起龋齿的发生。在这种情况下，如果缓冲剂存在，口腔中唾液和齿斑的pH稳定在中性pH左右，由此龋齿的形成似乎不会发生。
通常唾液的pH在中性左右。因此，在中性左右的pH具有良好的缓冲作用的缓冲剂是优选的。
较佳地，该缓冲剂是一种不与唾液中的磷酸盐反应而形成沉淀的试剂。
较佳地，该缓冲剂是一种不与唾液中的钙反应而形成沉淀的试剂。
较佳地，该缓冲剂是一种酸性官能团。
较佳地，该缓冲剂具有任何一种磷酸基、羧基、和硫酸基。
较佳地，该缓冲剂在其分子中具有三个或更少的酸性官能团，更佳地两个或更少的酸性官能团。当分子中存在过量的酸性官能团时，其向羟磷灰石供给磷和钙的能力似乎减少。例如，在它们的分子中具有一个或两个磷酸基的磷酸化寡糖具有改良的龋齿治疗的功能，超过在其分子中具有6个磷酸基的植酸的功能。因此，优选使用缓冲剂而不是例如植酸的一种物质。
具有极好的向羟磷灰石提供磷和钙的能力的缓冲剂是优选的。缓冲剂向羟磷灰石提供提供磷和钙的能力可通过如下述的简单的补充矿质的试验系统方法方便地测定。
缓冲剂的例子包括磷酸化寡糖及其糖醇。本文使用的术语“磷酸化寡糖”是指在其分子中具有至少一个磷酸基团的寡糖，较佳地三个或更少的磷酸基团，更佳地两个或更少的磷酸基团。本文使用的术语“中性寡糖”是指没有磷酸基团与其连接的寡糖。例如，该磷酸化寡糖可以是由α-1，4键连接的3-5个葡萄糖组成的葡聚糖，其中一个磷酸基团与葡聚糖连接。另外，磷酸化寡糖可以是由具有α-1，4键的2-8个葡萄糖组成的葡聚糖，其中两个磷酸基团与葡聚糖连接。缓冲剂的例子包括，但不限于酸性糖类及其糖醇(例如，寡半乳糖醛酸、硫酸软骨素、硫酸软骨素寡糖、葡萄糖-6-磷酸)，有机酸(例如酒石酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、延胡索酸、和马来酸)、核酸(例如各种核苷或核苷酸的磷酸酯)、氨基酸，和上述磷酸化寡糖的糖醇。
上述缓冲剂可以是盐的形式，例如金属盐，以使缓冲剂有效。用于形成这种金属盐的金属的例子包括碱性金属、碱土金属、锌、铁、铬和铅。例如，包括钾、钠、钙和镁。作为包含于本发明的膳食组合物的缓冲剂的金属盐，钙盐和钠盐是优选的。作为包含于本发明的口腔组合物的缓冲剂的金属盐，钙盐、钠盐和锌盐是优选的。虽然，锌盐不用于食物和饮料，但已知锌盐具有预防口臭和治疗牙周病的作用。因此，作为口腔组合物包含的金属盐锌盐是优选的。此外，缓冲剂可以是铵盐或季铵盐的形式。
硫酸软骨素典一般每两个糖之间含有一个硫酸基团。硫酸基团连接于硫酸软骨素A中N-乙酰-D-半乳糖胺的4-位，和硫酸软骨素C中N-乙酰-D-半乳糖胺的6-位。硫酸软骨素B(普遍地称为硫酸皮肤素)具有N-乙酰-D-半乳糖胺-4-硫酸和L-艾杜糖醛酸的双糖单元的重复结构。硫酸软骨素可被软骨素酶降解成为在非还原末端具有未饱和的己糖醛酸的寡糖的双糖。例如，硫酸软骨素可通过软骨素酶ABC(衍生自普通变形菌)、软骨素酶ACI(衍生自肝素黄杆菌)、或软骨素酶ACII(衍生自金黄节杆菌)(后两种酶不对硫酸皮肤素起作用)降解成为在它们的还原末端具有己糖胺的不饱和双糖。硫酸软骨素，和通过用这种酶降解硫酸软骨素获得的不饱和寡糖(较佳地双糖和四糖)具有补充矿质的作用。
寡半乳糖醛酸是一种聚合的半乳糖醛酸的寡糖，该寡糖已知为果胶的组成糖。寡半乳糖醛酸较佳地包含2个或更多的糖，更佳地3个或更多，甚至更佳地4个或更多，并且较佳地10个或更少，更佳地8个或更少，甚至更佳地6个或更少。
本文使用的术语“糖醇”是指其还原末端被还原的糖。例如，磷酸化寡糖的糖醇可通过向磷酸化寡糖的还原末端加入氢产生。氢的加入可使用本领域熟练的技术人员已知的任何方法进行。例如，可通过制备pH 8的1N氢氧化钠水溶液的弱碱溶液，向100ml的该弱碱溶液中加入30ml的3％氢氧化硼钠溶液，并使该混合物在40℃放置1小时还原寡糖。可通过使用本领域熟练的技术人员已知的镍催化剂的典型方法工业生产糖醇。
由于缓冲剂包含于本发明的膳食组合物和口腔组合物中，优选的磷酸化寡糖是由通过α-1，4键偶联的3-5个葡萄糖组成的葡聚糖，其中一个磷酸基团与葡聚糖连接，或磷酸化寡糖是由通过α-1，4键偶联的2-8个葡萄糖组成的葡聚糖，其中两个磷酸基团与葡聚糖连接。
这种磷酸化寡糖可从通常的天然植物淀粉制备，较佳地从具有许多磷酸基团的淀粉中制备。用于生产磷酸化寡糖的淀粉的起始植物的例子包括土豆、甘薯、木薯、玉米、小麦、水稻、糯米、糯玉米、糯小麦、糯土豆、野葛、山药、百合、和栗子。在这些物质中，地下茎、水稻、小麦等含有许多连接的磷酸基团，且是适合用于制备磷酸化寡糖的材料。例如，在马铃薯淀粉中，磷酸基团相对通常地通过酯键与葡萄糖的3-位或6-位结合作为淀粉的一个组分。磷酸基团主要存在于支链淀粉中。当淀粉用于生产磷酸化寡糖时，也可优选使用化学修饰的淀粉。化学修饰的淀粉通过连接磷与如上所述的天然淀粉获得。例如，取自玉米、糯玉米等的淀粉与磷化学偶联以制备磷酸化寡糖。
上述包含于本发明的膳食组合物和口腔组合物中的磷酸化寡糖可如下生产。
为了酶解淀粉等，使至少一种选自淀粉分解酶例如α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)、葡糖淀粉酶(CE 3.2.1.3)、异淀粉酶(EC 3.2.1.68)、支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)、和新支链淀粉酶(Kuriki等，Journal of Bacteriology，170卷，1554-1559页，1988)；和糖基转移酶例如环糊精葡聚糖转移酶(EC 2.4.1.19；下文中称为CGTase)对淀粉起作用。另外，至少一种上述的酶与α-葡糖苷酶结合使用。
不具有支链结构的磷酸化糖类可通过用异淀粉酶和支链淀粉酶切割淀粉中的α-1，6支链结构降解淀粉获得。如果不使用异淀粉酶和支链淀粉酶，可获得具有α-1，6支链结构的磷酸化糖类。通过用葡糖淀粉酶降解磷酸化糖类，与磷酸化糖类的非还原末端连接的非磷酸化葡萄糖可成功地释放。用这种酶处理，每单位分子量的纯化磷酸化糖类的磷酸基团的数量可增加或减少。
由大多数种类的酶的降解可通过使酶与淀粉反应同时进行。简言之，淀粉作为原料溶解于水或具有调节的pH的缓冲液中使酶可作用于淀粉。液化的α-淀粉酶、支链淀粉酶、葡糖淀粉酶等同时加入反应溶液中，并使得到的溶液在加热时反应。用这种方法，当淀粉被凝胶化时，可释放中性的糖类，可释放与磷酸化糖类的非还原末端结合的非磷酸化葡萄糖，或可切割从磷酸化糖类结构材料中的衍生的α-1，6支链结构。这种方法使通过一步反应获得具有增加的磷酸含量的磷酸化糖类成为可能，而不是两步反应。
在通过使大多数种类的酶在各个步骤中分别作用于淀粉进行包括两步或更多步骤的酶反应的情况下，应用酶的次序不限于具体的顺序。然而，如果淀粉的浓度高，较佳地淀粉首先用包括液化的淀粉酶的酶处理。如果使异淀粉酶或支链淀粉酶作用于淀粉，直链淀粉含量增加。直链淀粉与支链淀粉相比可能老化和沉淀，因此淀粉老化并沉淀。从而，其它的酶不再作用于淀粉。
对于所使用的淀粉降解酶、糖基转移酶、α-葡糖苷酶的起源没有具体的限制。例如，α-淀粉酶较佳地是衍生自芽孢杆菌属的细菌或曲霉属的淀粉降解酶制剂。酶的反应条件是酶可行使功能的任何温度和pH。例如，优选使用的温度在25℃到70℃的范围内，pH在4到8的范围内。
首先，作为原料的淀粉溶解于水或具有调节的pH的缓冲溶液中，这样酶可作用于淀粉。液化的α-淀粉酶加入获得的溶液中，并使之在加热时反应，借此当被凝胶化时淀粉液化。此后，液化的淀粉在20-80℃的温度保持适当的一段时间。只要它可以液化淀粉可使用任何量的液化的α-淀粉酶。较佳的液化α-淀粉酶的量为20-50,000U。只要淀粉液化到在随后的步骤过程中淀粉不老化的程度，该保持时间没有限制。较佳地，在20-80℃保持时间为30分钟。
在液化完成后，不特别需要酶的灭活，但酶可通过通常使用的方法灭活，即在100℃保持10分钟。此外，可用通常使用的方法例如离心或膜过滤分离和除去不溶解的物质。此后，磷酸化的糖类可被分馏。当需要具有增加的磷酸含量的磷酸化糖类时，进行下述的另外的步骤。
简言之，原料被液化后，葡糖淀粉酶、异淀粉酶、支链淀粉酶、和α-葡糖苷酶同时或以适当的次序加入液化的原料以使原料糖化。例如使糖化的原料在40-60℃的温度反应30分钟到40小时，借此中性的糖和与磷酸化糖类的非还原末端连接的非磷酸化葡萄糖可从原料中释放，并且衍生自原料的磷酸化糖类结构中的α-1，6支链结构可被切割。当葡糖淀粉酶、异淀粉酶、和支链淀粉酶结合使用时，该结合及添加的次序没有限制。添加的酶的量以及保持的时间可取决于所需的磷酸化糖类的磷酸含量而确定。较佳地，可加入葡糖淀粉酶500-700U，异淀粉酶2-100U，支链淀粉酶2-100U，和α-葡糖苷酶50-700U。较佳地可使用固定化酶。
与各个酶的反应完成后，不特别需要酶的灭活，但可用通常使用的方法灭活酶，即在100℃保持10分钟。此外，用通常使用的方法例如离心或膜过滤分离和除去不溶的物质。
为了从含有磷酸化寡糖的糖类混合物中纯化磷酸化寡糖，因为不象中性糖类磷酸化糖类是离子物质，所以可使用阴离子交换树脂。对于树脂的类型没有具体的限制。树脂较佳的例子包括Chitopearl BCW 2500型(由Fuji Spinning Co.，Ltd.生产)，Anberlite IRA型(由Japan Organo Co.，Ltd生产)，DEAE-纤维素(由Whatman生产)，DEAE-Sephadex和QAE-Sephadex(由Pharmacia生产)，和QAE-CELLULOSE(由BioRad生产)。通过使用其pH适当调节的缓冲液平衡树脂。例如，优先使用约10-50mM乙酸盐缓冲液。平衡的树脂装入柱，并装入含有磷酸化寡糖的糖混合物。通过洗涤除去中性糖类，然后吸收到柱上的磷酸化寡糖用碱性溶液或盐溶液洗提。
在使用增加了离子强度的洗提液洗提磷酸化寡糖的情况下，对所使用的盐的种类没有具体限制。盐的较佳的例子包括氯化钠、碳酸氢铵、氯化钾、硫酸钠和硫酸铵。
在使用pH改变为碱性的洗提液洗提磷酸化寡糖的情况下，对于使用的碱性试剂的种类没有具体限制。例如，可使用铵、碳酸钠或氢氧化钠。然而，在强碱条件下，磷酸基团从糖中释放或糖的还原末端被氧化。因此，磷酸化寡糖较佳地在弱酸到弱碱的pH范围内洗提，更佳地pH范围为3-8。
在上述情况下，通过使用逐渐或以分步形式增加洗提液的盐浓度或pH洗提磷酸化糖，磷酸化糖可依赖于与一个磷酸化糖分子结合的磷酸基团的数量进行分馏。
活性炭也可用来代替阴离子交换树脂以从含有磷酸化寡糖的糖混合物中纯化磷酸化寡糖。对于使用的活性炭的种类没有具体限制，但较佳地使用能够装入柱的颗粒状活性炭。使用缓冲液、酸、碱、盐溶液和蒸馏水制备活性炭，这样获得吸附除葡萄糖外的中性糖类的能力。例如，较佳地可使用已装入柱并用蒸馏水洗涤的具有一致粒径的脱气的活性炭。通过将样品加到柱上并使中性糖类吸附到柱上，磷酸化寡糖可作为通过的部分获得。
另外，通过加入具有1-3个碳原子的醇沉淀磷酸化寡糖，以从含有磷酸化寡糖的糖混合物中纯化磷酸化寡糖。简言之，向样品溶液中加入醇仅仅使磷酸化寡糖沉淀。期望的是，如果样品溶液具有10％或更大的糖浓度，向一份体积的样品溶液中加入3份或更多体积的醇。
在金属盐、较佳地是钙盐或铁盐加上醇存在的条件下，磷酸化寡糖形成磷酸化糖金属盐并可能沉淀。由于这个原因，在有金属盐的情况下，使用即使少量的醇与仅使用醇的情况比较，磷酸化寡糖更易回收。较佳地，在碱性条件下磷酸化寡糖沉淀。对使用的盐的种类没有具体的限制。例如，较佳地可使用氯化钙、氯化镁、或氯化亚铁，因为它们具有良好的溶解性。通过加入醇产生的沉淀的收集来用通常使用的方法进行，例如倾析、过滤和离心。
磷酸化寡糖可通过从磷酸化寡糖金属盐中除去金属盐产生，该磷酸化寡糖金属盐通过加入金属盐沉淀。可通过通常使用的方法进行金属盐的去除(脱盐)。脱盐可使用例如台式脱盐microacilyzer G3(由Asahi Chemical Industry Co.Ltd生产)容易地进行。
得到的磷酸化糖溶液、磷酸化糖或磷酸化糖衍生物可使用通常所用的干燥方法，例如热空气干燥、流化床干燥和真空干燥等浓缩或研粉。如果需要，通过除去醇可获得可用于膳食或口服应用的磷酸化糖。
在马铃薯淀粉中，磷酸基团相对通常地以酯键与葡萄糖的3-位或6-位连接作为淀粉的一个组分。因此，使用各种淀粉酶从马铃薯淀粉中制得的磷酸化寡糖可能是其磷酸基团主要与葡萄糖的3-位或6-位结合的寡糖。例如，如果磷酸基团结合于通过使葡糖淀粉酶作用于马铃薯淀粉获得的磷酸化寡糖中的葡萄糖的6-位，该淀粉可在其6-位具有磷酸基团的葡萄糖前(在非还原末端一侧)立刻被切割。因此，磷酸化寡糖是具有葡萄糖的寡糖，该葡萄糖的6-位在非还原末端与磷酸基团结合或者该葡萄糖具有一种结构，该结构中从非还原末端开始至少第二个葡萄糖其6-位与磷酸基团结合。如果磷酸基团与磷酸化寡糖中葡萄糖的3-位结合，从非还原末端开始的第二个葡萄糖的3-位与磷酸基团结合。图26中显示了通过使用各种淀粉酶水解马铃薯淀粉获得的磷酸化寡糖的代表性的例子。当然，具有上述结构的磷酸化寡糖不限于经各种淀粉酶水解马铃薯淀粉生产的寡糖。具有相似结构的磷酸化寡糖具有相似的抗龋齿功能。
本文使用的术语“磷酸化寡糖的糖醇”是指通过还原磷酸化寡糖的还原末端获得的化合物。上述磷酸化寡糖的糖醇可通过向磷酸化寡糖的还原末端加入氢生产。可使用本领域熟练的技术人员已知的任何方法进行氢的加入。例如，可通过制备pH 8的1N氢氧化钠水溶液的弱碱溶液，加入30ml的3％氢氧化硼钠溶液，并使混合物在40℃放置1小时还原寡糖。可通过使用本领域熟练的技术人员已知的镍催化剂的典型的方法工业生产糖醇。
上述磷酸化寡糖或其糖醇可以是盐的形式，例如金属盐。用于形成这种金属盐的金属的例子包括碱性金属、碱土金属、锌、铁、铬和铅。例如，包括钾、钠、钙和镁。作为包含于本发明的膳食组合物中的磷酸化寡糖的金属盐，钙盐和钠盐是优选的。作为包含于本发明的口腔组合物中的磷酸化寡糖的金属盐，钙盐、钠盐和锌盐是优选的。虽然，锌盐不用于食物和饮料，但已知锌盐具有预防口臭和治疗牙周病的作用。因此，作为口腔组合物包含的金属盐锌盐是优选的。此外，磷酸化寡糖可以是铵盐或季铵盐的形式。
这种金属盐可如下进行生产。磷酸化寡糖和金属盐的化合物磷酸化寡糖盐可通过如上述的醇沉淀进行沉淀。如果需要，回收的沉淀可再溶解于水或适当的溶液中，随后加入醇。可重复这一操作。使用这一操作，可除去如中性糖和过量的盐等杂质。可使用超滤膜除去如盐等杂质。
已知上述磷酸化寡糖具有如下特性(1)不被龋齿致病菌所利用(即变异链球菌和表兄链球菌)；(2)抑制由于通过这些细菌以浓度依赖性的形式利用蔗糖产生的pH中的还原；和(3)这种抑制依赖于磷酸化寡糖的缓冲能力(见日本公开出版物8-104696号)。根据本发明，进一步发现盐形式的磷酸化寡糖及其糖醇具有在非常低的浓度促进牙齿补充矿质的作用。通过利用磷酸化寡糖的这种特性，可获得具有抗龋齿功能的膳食组合物和口腔组合物。具体地说，在低浓度充足地获得补充矿质作用的事实对于加入到食物中是非常有利的。
本发明的膳食组合物和口腔组合物含有一定量的缓冲剂，这样缓冲剂在口腔中有效地显示抗龋齿的功能。例如，就磷酸化寡糖钠盐来说，其量可以在口腔中盐的浓度是0.01-20％，较佳是0.03-1％。例如，就磷酸化寡糖钙盐来说，其量可以在口腔中盐的浓度是0.01-20％，较佳是0.03-1％。例如，就磷酸化寡糖锌盐来说，其量可以在口腔中盐的浓度是0.01-20％，较佳是0.03-1％。对于所有的磷酸化寡糖钠盐、磷酸化寡糖钙盐、和磷酸化寡糖锌盐，最佳地，它们在口腔中的浓度为约0.2％，其中口腔中无机钙和磷的浓度为约1.5mM和0.9mM。
通过考虑在口腔中本发明的膳食组合物和口腔组合物的保留时间确定这些添加剂的量。对于需要咀嚼行为的膳食组合物将给出一种意向。例如，就含有约20％磷酸化寡糖的口香糖来说，磷酸化寡糖从膳食组合物中洗提，并且咀嚼后相对高浓度(约1％到约5％)的磷酸化寡糖可存在约10分钟。约20分钟到30分钟后，只有0.25％或更少的磷酸化寡糖存在于口腔中。因此，口腔中磷酸化寡糖的浓度被稀释为食物中浓度的1/4或更少。因此，就这种食物来说，缓冲剂可以预期在口腔中的四倍或少一些的浓度加入食物中(例如，一到四倍)。另一方面，关于不需要咀嚼行为的组合物(例如饮料)，在口腔中的保留时间在1分钟以内。这种组合物在口腔中没有充分地稀释。因此，磷酸化寡糖以基本上等于口腔中期望浓度(例如，0.1％到5％)掺入组合物。本发明的膳食组合物和口腔组合物可含有单独的或结合的上述的缓冲剂，这样可在口腔中保留上述的剂量。
另一方面，本发明的膳食组合物和口腔组合物进一步含有任何一种磷-钙补偿剂、磷制剂和钙制剂、或另外除上述缓冲剂外一种或多种的组合。具体地说，当组合物包含钙盐时，过量的钙从钙盐中释放，以致组合物中钙磷比发生变化。而且，加入的缓冲剂可对从牙齿中洗提钙有影响。在这种情况下，如果通过缓冲剂改变的口腔唾液中磷钙浓度的比被补偿，牙齿补充矿质可更加有效。对于正常人，唾液中钙磷的摩尔比(下文中称为“Ca/P”)通常为0.25-0.67(P/Ca＝1.45-3.9)，因此，存在的磷比钙多(即，差不多3摩尔磷比2摩尔钙到3.9摩尔磷比1摩尔钙)。牙齿的组分羟磷灰石(表示为Ca10(PO4)6(OH)2))具有1.67的Ca/P比(P/Ca＝0.6)。组成牙齿釉质的成分具有1.0-1.67的Ca/P比(P/Ca＝0.6-1.0)。因此，通过和缓冲剂一起提供磷和/或钙使Ca/P接近1.0-1.67(P/Ca＝0.6-1.0)，较佳地1.67((P/Ca＝0.6)，它可能促进这些物质结晶进入羟磷灰石。
可补偿Ca/P的试剂这里称为“磷-钙补偿剂”。这种磷-钙补偿剂的例子包括一价的磷酸钙(Ca(H2PO4)2·H2O)、二价的磷酸钙(CaHPO4·2H2O)、三价的磷酸钙、焦磷酸钙、羟磷灰石粉、无定形磷酸钙、牛骨钙、蛋壳钙、珊瑚钙、珍珠钙、鱼和贝类的钙、以及三价的α-磷酸钙。本文中补偿Ca/P是指保持Ca/P基本上约在1.0-1.67(P/Ca＝0.6-1.0)的范围内。在这种情况下，Ca/P不需要严格地限制在1.0-1.67(P/Ca＝0.6-1.0)。只要Ca/P可基本上接近约1.0-1.67(P/Ca＝0.6-1.0)，Ca/P可下降至1.0-1.67(P/Ca＝0.6-1.0)的范围之外。补偿所需的补偿剂的量随缓冲剂和补偿剂的种类而变化，但是如果需要，这种量的范围可通过本领域熟练的技术人员进行简单的试验确定。就磷-钙补偿剂而言，对于加入的一份缓冲剂，其适当的摩尔量为1/20份至20份，较佳地1/2份到2份。
既然磷在唾液中是过量的，可使用Ca制剂调整Ca/P到1.0-1.67(P/Ca＝0.6-1.0)。在人的唾液中，磷浓度是3-3.5mM，而钙浓度是0.9-2mM。因此，较佳地加入约4-5mM的钙以提高钙浓度。因此，可使用钙盐(缓冲剂)作为磷-钙补偿剂。就含有3％钙的磷酸化寡糖而言，加入约0.7％磷酸化寡糖钙是适当的。钙制剂较佳的例子包括，但不限于碳酸钙、氯化钙、乳酸钙、葡萄糖酸钙、乳清钙、有机酸钙、胶体碳酸钙、酪蛋白磷肽钙和氟化钙。
本发明的膳食组合物和口腔组合物进一步含有磷制剂。本文使用的术语“磷制剂”是指磷酸盐化合物。磷酸盐化合物的例子包括磷酸钠、磷酸氢钠、磷酸钾、和磷酸氢钾。
上述磷-钙补偿剂、磷制剂、或钙制剂可单独或结合加入本发明的膳食组合物和口腔组合物以使Ca/P接近1.0-1.67(P/Ca＝0.6-1.0)，并较佳地为1.67(P/Ca＝0.6)。
本文使用的术语“膳食组合物”是人的食物、饲养动物或鱼的饲料、和宠物食物的总称。具体而言，本发明的膳食组合物包括液体和粉末饮料如咖啡、茶、绿茶、乌龙茶、果汁、加工牛奶、和运动饮料；焙烤食物例如面包、比萨饼和馅饼；焙烤甜食例如曲奇饼、脆饼、饼干和蛋糕；意大利面食如意大利式细面条和通心粉；面条例如小麦面条、荞麦面条、和中式面条；甜品例如糖果、软糖、口香糖、和巧克力；小吃例如爆米花和马铃薯片；冰冻甜食例如冰激凌和果汁牛奶冻；乳制品例如奶油、干酪、奶粉、炼乳和乳制饮料；西方不烘焙的糖果类点心例如果冻、布丁、奶油冻、和酸牛奶；日本甜食例如奶油小圆甜面包、uirou(通过向面粉中加入糖，随后蒸煮获得的切成方形年糕)、年糕、和ohagi(用豆酱等包裹的米团)；调味品例如酱油、蘸的调味汁、面条汤、辣酱油、原汁肉汤、炖家畜、汤、混合的调味品、咖哩粉、蛋黄酱、和番茄沙司；听装或杀菌袋装食物例如咖喱、炖肉、汤和米饭；冷冻和冷藏食品例如火腿、汉堡包、肉圆、炸丸子、中国式汤团、炒饭和米团；海加工产品例如tikuwa(管状鱼酱)和kamaboko(鱼酱饼)；和米制产品例如野外午餐的米饭和寿司。另外，由于本发明的膳食组合物具有使钙易于吸收的能力，因此它包括配制的婴儿喂养奶、断乳食品、婴儿食品、宠物食品、动物饲料、运动食品、营养滋补品和保健品。
在一个较佳的实施例中，食物和饮料是在食用时需要大量咀嚼的种类，例如口香糖。就被大量咀嚼的食物和饮料来说，缓冲剂容易地在口腔中扩散，产生抗龋齿的良好效果。就被大量咀嚼的食物和饮料来说，较佳地缓冲剂可以0.1-50％的重量比，更佳地0.5-20％的重量比，甚至更佳地0.5-10％的重量比，特别优选地0.5-5％的重量比加入食物中。具体地，例如，这种食物是含有0.1-50％的重量比的缓冲剂的口香糖，或含有0.1-50％的重量比的缓冲剂的片状糖食、糖果、软糖等。
在另一个较佳的实施例中，食物和饮料是在食用时不需要咀嚼的种类，例如饮料(如果汁或淡水)。就食用时不需要咀嚼的食物或饮料来说，较佳地缓冲剂可以0.1-70％的重量比，更佳地0.1-50％的重量比，甚至更佳地0.2-5％的重量比混合到食物中。具体地说，例如，该食物是含有重量比为1-30％的缓冲剂的果汁。较佳地，该食物是含有重量比为0.1-10％的缓冲剂的蔬菜汁、天然果汁、乳制饮料、牛奶、豆奶、运动饮料、近水饮料、营养饮料、咖啡饮品、或可可饮料。
在另一个较佳的实施例中，食物和饮料是在食用时与平常主食咀嚼一样多的种类。较佳地，该食物和饮料是主食和饮料。例如，这种食物是米饭。就主食来说，既然以足够的量食用食物，即使加入少量的缓冲剂有利地提供了预防龋齿的显著和长期的效果。就与平常主食物咀嚼一样多的食物来说，较佳地缓冲剂可以0.01-20％的重量比，更佳地0.02-10％的重量比，甚至更佳地0.03-5％的重量比，特别优选地0.05-3％的重量比加入食物中。具体地说，该食物是，例如含有重量比为0.02-10％的缓冲剂的米饭，含有重量比为0.01-20％磷酸化寡糖的面包等。
当然，本发明可用于除了上述较佳的实施例中所描述的那些以外的食物和饮料。具体而言，本发明可用于，例如，含有重量比为0.1-20％的缓冲剂的中国面条，含有重量比为0.1-20％的缓冲剂的小麦面条，含有重量比为0.1-20％的缓冲剂的年糕，含有重量比为0.1-20％的缓冲剂的椒盐卷饼，含有重量比为0.1-20％的缓冲剂的琼脂，含有重量比为0.1-20％的缓冲剂的果冻，含有重量比为0.1-20％的缓冲剂的酸牛奶，含有重量比为0.1-20％的缓冲剂的曲奇饼，含有重量比为0.1-20％的缓冲剂的片状甜食，含有重量比为0.1-20％的缓冲剂的豆腐，含有重量比为0.1-20％的缓冲剂的巧克力，含有重量比为0.1-20％的缓冲剂的米制甜食，含有重量比为0.1-20％的缓冲剂的中国汤团，和含有重量比为0.1-20％的缓冲剂的火腿。
本文使用的术语“口腔组合物”是指不同于食物和饮料的任何组合物，该组合物能引入口腔并能与牙齿接触。口腔组合物可以是药物或准药品或其它化合物。例如，该“口腔组合物”进一步包括化妆品(更具体地说，具有预防龋齿、增白牙齿、除去齿斑、清洁口腔、预防口臭、除去焦油、预防牙垢沉积等作用的洁牙剂(它是在日本药物法Japanese Pharmaceutical Affairs Law(2001年修订)下承认的化妆品)。具体而言，本发明的口腔组合物包括，例如，洁牙剂、嗽口剂、糖锭、含漱液、牙龈按摩膏、锭剂、人工唾液等。
在一个较佳的实施例中，本发明的口腔组合物是较佳地含有重量比为0.01-20％、更佳地重量比为0.02-10％、甚至更佳地重量比为0.03-5％，和特别优选地重量比为0.05-3％的缓冲剂的洁牙剂。
在一个较佳的实施例中，本发明的口腔组合物是较佳地含有重量比为0.01-20％、更佳地重量比为0.02-10％、甚至更佳地重量比为0.03-5％，和特别优选地重量比为0.05-3％的缓冲剂的嗽口药。
在一个较佳的实施例中，本发明的口腔组合物是较佳地含有重量比为0.01-20％、更佳地重量比为0.02-10％、甚至更佳地重量比为0.03-5％，和特别优选地重量比为0.05-3％的缓冲剂的口腔软膏。
优选地，本发明的口腔组合物是含有重量比为0.01-20％的缓冲剂的洁牙剂、漱口药、糖锭、含漱液、人工唾液等。
已使用人工唾液改善口干燥症。该人工唾液含有与人唾液基本上相同的组分，例如矿物质。含有上述缓冲剂的人工唾液不仅能湿润舌和喉粘膜使舌和喉粘膜平滑移动，还能预防和治疗龋齿。
本发明的膳食组合物和口腔组合物还任选地含有氟。本发明的膳食组合物和口腔组合物包含在1000ppm或更少，较佳地0.1-500ppm和更佳地0.1-300ppm的范围内。为了提高100ppm或更多的氟的效能，缓冲剂适用于药物、准药物和化妆品。本发明的膳食和口腔组合物可通过进一步含有氟而具有较高水平的牙齿补充矿质的效果。这里，“氟”包括氟离子。术语“含氟的物质”是指提供氟离子的任何物质，较佳地含有氟离子的化合物(例如，单氟磷酸钠、氟化钠、氟化钾、氟化铵、胺盐氟化物、和氟化锡)。较佳地使用单氟磷酸钠和氟化钠。
仅使用氟或含氟的物质导致低水平的牙齿补充矿质。特别是，氟和含氟的物质在100ppm或更高的浓度可能不溶解，导致效能明显下降。然而，在本发明中，发现缓冲剂与氟或含氟的物质一起使用导致效能的提高。对于食物，含有大量氟(200-300ppm)的茶等是优选的。氟或含氟的物质掺入牙齿晶体以产生抗酸的坚固晶体。因此，本发明的膳食组合物和口腔组合物涉及坚固的牙齿晶体的生产以及牙齿补充矿质，从而减少龋齿的产生。
本发明的膳食组合物和口腔组合物可进一步包含本领域熟练的技术人员已知的具有抗龋齿功能的其它物质。这种物质的例子包括各种寡糖(潘糖(62-葡糖基-麦芽糖)、异麦芽低聚糖、异蔗糖(6-O-α-葡糖吡喃糖基-D-呋喃果糖)、海藻糖(O-α-D-葡糖吡喃糖基(1-1)-α-D-吡喃葡萄糖苷)、麦芽低聚糖、乳蔗糖TM(4G-β-D-半乳糖基蔗糖)、呋喃低聚糖、偶联糖、木糖基果糖苷、环糊精等)；糖醇(木糖醇、赤藻糖醇、palatinit、山梨醇、麦芽糖醇、甘露醇等)；茶叶提取物(氟、多酚、儿茶素等)；草药(例如薄荷、薄荷油、春黄菊、鼠尾草、姜、迭迭香等，见Shibuya等，香料杂志特刊FRAGRANCEJOURNAL SPECIAL ISSUE，12，150-155页，1992)；酶(例如，葡聚糖酶、变位酶等)；和疫苗(例如分泌的抗变异链球菌的免疫球蛋白A)。糖醇是优选的。木糖醇是更优选的。本发明的膳食组合物和口腔组合物通过含有上述物质可具有预防龋齿的增强效果。
可使用已知的方法检测缓冲剂的补充矿质的效果，例如一个使用牛牙齿切片的补充矿质的试验系统，它描述于Inaba.D等，Eur.J.Sci.10574-80，1997；Inaba.D等，J.Dent.Health.4767-74，1997；和Iijima.Y等，Dental Caries Research.33206-213，1999。
为了测定包含于本发明的膳食组合物和口腔组合物中的缓冲剂的补充矿质的效果，本发明的发明者开发了与上述补充矿质试验系统相比较简单的试验系统。例如，补充矿质容易发生的条件如下向牙齿表面(羟磷灰石)的接触表面快速提供钙和磷，并将它们掺入牙齿成分(羟磷灰石)；在包括牙齿表面的系统中保持较高的钙和磷浓度；除牙齿表面外的区域没有钙和磷的沉积或流失。如下简化这些用于容易补充矿质的条件在包括羟磷灰石的系统中提供用于结晶的钙和磷并减少可溶的钙；和在不包括羟磷灰石的系统中，磷和钙不沉积并保持其较高的溶解度。因此，比较这两个系统中钙的溶解度的大小以检测补充矿质的效果。这些简单的试验系统将在下文中描述。TMR(横向显微放射显影术)方法作为一种用于以定量的方式测定牙质矿物质浓度的分布的标准方法已用于大量的对脱矿质和补充矿质的研究。对于这种方法，有如下限制需要长时间进行评估；需要高水平的试验技术等。因此，需要一个能够迅速捕获牙质矿物质浓度变化的简单的评价系统。通过如下两个步骤考虑开发在牙齿釉质的早期龋齿损伤中补充矿质(i)将釉质的组分钙(Ca)离子和磷(P)离子提供给脱矿质的部分；和(ii)提供的Ca离子和P离子用于脱矿质的部分中釉质的晶体生长。
鉴于上述两个步骤，一种具有促进补充矿质作用的物质被认为是一种在中性pH下抑制Ca和P的不溶解和沉淀但不抑制羟磷灰石的晶体生长的物质。
这些试验系统与上述使用牛牙齿的常规系统有关，并建立了一个简单和极好的方法。
在本发明的一个方面，本发明涉及研究预期具有抗龋齿作用的样品对牙齿补充矿质的效果的方法。该方法包括如下步骤(A)在有样品的情况下，在含有磷、钙以及牙齿成分的溶液中沉淀钙；(B)沉淀后测定溶液中钙的浓度或沉淀的钙的量；(C)在不含样品的溶液中沉淀钙；(D)沉淀后测定溶液中钙的浓度或沉淀的钙的量；和(E)比较步骤(B)和(D)中钙的浓度或沉淀的钙的量。在一个较佳的实施例中，上述溶液可包含羟磷灰石、缓冲液、K2HPO4和CaCl2。包含于上述溶液的“牙齿成分”是由于补充矿质，沉淀磷和钙以产生羟磷灰石的任何物质。羟磷灰石的使用是优选的。另外，可使用如牛等哺乳动物的牙齿、和其切片或分馏物。当制备用于钙沉淀的溶液时，添加上述磷、钙和其它牙齿成分的次序没有限制。较佳地，以如下次序添加以制备溶液，首先是样品，然后是磷、氯化钙溶液，和牙齿成分悬浮液或去离子水。较佳地，添加K2HPO4后调整溶液的pH。一般通过在室温下培育十几个小时到几天产生钙沉淀(较佳地10小时到7天，更佳地18小时到42小时)。可使用本领域熟练的技术人员已知的任何方法测定溶液的钙溶解度。溶液的钙溶解度可通过OCPC方法测定(使用由Wako Pure Chemicals生产的“Calcium Ctest Wako”)。另外，可测定溶液中沉淀的钙的量。可使用本领域熟练的技术人员已知的任何方法测定溶液中沉淀的钙的量。溶液的钙溶解度可使用本领域熟练的技术人员已知的任何方法测定。这种方法的例子包括ICP方法(诱导性偶联的等离子体方法)、原子吸收分析和离子电极方法。
为了测定抗龋齿的功能，一种人造口腔设备用于获得尽可能真实的脱矿质的釉质(见例如Jpn.J.Oral Biol.20288-291，1984)。例如，该设备可包含一个电极、附着在电极周围的釉质切片、和变异链球菌细胞悬浮液、培养液、和滴下糖溶液的工具。使用这种设备，合成不溶于水的葡聚糖的变异链球菌附着在电极表面形成一个人工空斑，从而产生低的pH。而且，一个人工空斑相似地在釉质部分上形成，导致釉质硬度的显著下降。
(实施例)下文中，将以实施例的方式详细描述本发明。这些实施例不是要限制本发明。用于实施例的材料、试剂等除非另外提及均为商业购得。
(实施例1)实施例1显示了生产用于本发明组合物的磷酸化寡糖的方法。
首先，当1％的马铃薯淀粉溶液溶解于含有6mM氯化钠和2mM的氯化钙的5ml溶液中时迅速加热到100℃以凝胶化。此后，使35U的由Hankyu Bioindustry Ltd.生产的α-淀粉酶(Fukutamirase)作用于凝胶化的混合物，并在50℃保持30分钟。少量的反应液用于制备0.2％的糖溶液。1/10份的0.01M的碘-碘化钾溶液加入一份的糖溶液中。在碘量滴定法中证实产生的混合物是阴性的。此后，同时使2U的支链淀粉酶(由Hayashibara Biochemical Lab.生产)和6U的葡糖淀粉酶(由Toyobo Co.，Ltd.生产)在40℃作用于混合物20小时。终止反应，随后离心。将上清液应用于用20mM乙酸盐缓冲液(pH 4.5)平衡的阴离子交换树脂柱(Chitopearl BCW 2501；由FujiSpinning Co.，Ltd生产)。该柱用乙酸盐缓冲液彻底洗涤以除去中性糖类，随后用含有0.5M氯化钠的乙酸盐缓冲液洗提。各个洗提的部分用蒸发器浓缩、脱盐、并冻干，由此获得磷酸化寡糖。
这样获得的磷酸化寡糖再次用于用20mM乙酸盐缓冲液(pH 4.5)平衡的阴离子交换树脂柱(Chitopearl BCW 2501)。该柱用乙酸盐缓冲液彻底洗涤以除去中性糖类。使该柱用含有0.15M氯化钠的乙酸盐缓冲液和然后用含有0.5M氯化钠的乙酸盐缓冲液洗提。收集的部分脱盐并冻干。根据上文提到的用于确定结构的方法分析这些部分，表明在从0.15M氯化钠洗提的部分中(PO-1部分)获得的磷酸化糖中，一个磷酸基团与具有含α-1，4键的3-5个葡萄糖的葡聚糖结合；并在从0.5M氯化钠洗提的部分中(PO-2部分)获得的磷酸化糖中，两个或更多的磷酸基团与具有含α-1，4键的2-8个葡萄糖的葡聚糖结合。
上述磷酸化寡糖的结构分析如下进行。
首先，从磷酸化寡糖中除去磷酸基团。100μl、3％磷酸化寡糖溶液与100μl含有10mM氯化镁、0.3mM氯化锌、和0.05％叠氮钠的60mM碳酸钠缓冲液(pH 9.4)混合。100μl、30U/ml碱性磷酸酶(EC.3.1.3.1；衍生自大肠杆菌由SIGMA生产)加入混合物，然后使之在40℃反应18小时。通过使用超滤膜除去碱性磷酸酶终止反应，由此获得含有已除去磷酸基团的糖(下文称为脱磷酸糖)的反应液(下文中称为反应液A)。
向10μl得到的反应液A加入溶解于10μl的200mM乙酸盐缓冲液(pH 4.8)的5000U/ml的β-淀粉酶(产生自甘薯；由SIGMA生产)，得到的混合物在37℃保留2小时(得到的液体称为反应液B)。相似地，溶解于10μl的60mM乙酸盐缓冲液(pH 4.5)的300U/ml的糖淀粉酶(衍生自根霉菌属；由Totobo Co.，Ltd.生产)加入10μl的反应液A，得到的混合物在35℃保留18小时(下文中得到的液体称为反应液C)。
分析反应液A-C以证实其中的产物。通过使用阴离子交换树脂柱，CarboPacPA-100(Ф4×250mm，由Dionex Corp.生产)的高效液相色谱或使用硅胶的薄层层析分析这些液体证实这些反应液中的产物，并将分析结果与具有各种聚合度的标准麦芽低聚糖的产物作比较。使用高效液相色谱洗提脱磷酸糖通过使用100mM氢氧化钠作为基础溶液，提高1M的乙酸钠的浓度进行。脱磷酸糖的检测使用脉冲电流检测器(由Dionex Corp.生产)进行。使用薄层层析分析脱磷酸糖可通过用乙腈/水(80/20)多重展开脱磷酸糖，喷洒硫酸/甲醇溶液(＝1/1)，并在130℃保留3分钟进行。
分析反应液A，以便确定磷酸化寡糖的链长。当分析反应液B时，只检测到麦芽糖和麦芽三糖(和少量的葡萄糖)。因此，证实脱磷酸糖是葡聚糖，其中葡萄糖通过α-1，4键互相连接。而且，当分析反应液C时，仅检测到葡萄糖。因此证实脱磷酸糖是由α-键连接的葡萄糖组成。
糖的平均链长(下文中，由DP代表，使用葡萄糖作为一个单位)从具有各种聚合度的脱磷酸糖类的糖含量获得。整个磷酸化糖类的总糖含量使用苯酚-硫酸方法测定。连接的磷酸基团的数量作为通过使脱磷酸糖类湿灰化(与淀粉相关的糖类试验方法，《生化试验方法》(Biochemistry experimental method)19，M.Nakamura等，31页，1986，JSSP Tokyo)获得的无机磷酸确定。根据如下公式，使用脱磷酸糖类湿灰化后确定的无机磷酸的量和DP计算每分子结合的磷酸基团的数量(每分子结合的磷酸基团的平均数量)＝ (实施例2)含有每分子具有一个磷酸基团的磷酸化寡糖的PO-1部分和含有每分子具有两个磷酸基团的磷酸化寡糖的PO-2部分各10g溶解于100ml的蒸馏水中。使用电透析仪(Micro acilyzer)G3、AC210-400膜由Asahi Kasei Co.，Ltd生产)除去这些水溶液中的盐分，然后使用强阳离子交换树脂(Dowex 50w 20-50MESH，H-型由NisshinKasei生产)进行离子交换，由此获得pH2.7的糖溶液。用1N氢氧化钠或氢氧化钙溶液中和得到的溶液，随后冻干，由此制得磷酸化寡糖钠盐或钙盐。
在下面的实施例中使用的磷酸化糖类(以钠盐或钙盐的形式)是含有80％或更多的上述PO-1部分的磷酸化糖和PO-2部分的磷酸化糖的剩余物的磷酸化糖类混合物。
(实施例3)在实施例3中，使用牛牙齿断片的系统用于澄清磷酸化寡糖对于早期龋齿补充矿质的作用。
该试验的进行基本上根据Inaba.D等，Eur.J.Sci.10574-80，1997；Inaba.D等，J.Dent.Helth.4767-74，1997；和Iijima.Y等，Caries Research.33206-213，1999。
在试验中使用的牙齿断片如下制备放置每边3mm的立方的牛牙齿断片以便其釉质表面向上。除釉质表面外用合成树脂覆盖断片。用湿的研磨砂纸处理釉质。脱矿质如下进行牙齿断片在37℃浸没于含有6％羧甲基纤维素凝胶的1％乳酸凝胶(pH5.0)中3周。补充矿质如下进行在37℃，脱矿质的牙齿断片浸没于含有1.5mMCaCl2和0.9mM KH2PO4的20mM 2-[4-(2-羟乙基)]-1-哌嗪乙磺酸盐(HEPES)缓冲液(pH7.0)中一周。
制备如下8个试验组(1)仅脱矿质(空白；图1和2中的“空白”)；(2)仅补充矿质(阴性对照；图1和2中的“对照”)；(3)补充矿质溶液+2ppm氟(F)(阳性对照；图1和2中的“2ppm F”)；(4)补充矿质溶液+4.0％磷酸化寡糖钠盐(图1和2中的“POsNa 4％”)；(5)补充矿质溶液+1.0％磷酸化寡糖钠盐(图1和2中的“POs Na 1％”)；(6)补充矿质溶液+0.2％磷酸化寡糖钠盐(图1和2中的“POs Na 0.2％”)；(7)补充矿质溶液+0.2％磷酸化寡糖钙盐(图1和2中的“POs Ca 0.2％”)；和(8)补充矿质溶液+0.07％磷酸化寡糖钙盐(图1和2中的“POs Ca 0.07％”)。
经过各个处理后，从各个处理的牙齿断片中制备200μm厚的切片，从显微放射照相的图象(未显示)分析其矿物质浓度的分布。当牙齿断片被脱矿质时，矿物质从牙齿断片洗脱并流失，其中依次产生空腔(龋齿发作)。图1显示根据该矿物质浓度分析矿物质流失值的图(垂直轴表明矿物质流失值)。图2显示脱矿质的深度[垂直轴表明损伤深度(μm)]。根据图1，对于磷酸化寡糖钠和磷酸化寡糖钙，在测试浓度的最低浓度水平上，矿物质损失最少。该矿物质损失少于(2)阳性对照的损失。就磷酸化寡糖钠和磷酸化寡糖钙来说，得到浅的损伤深度(图2)。这表明空腔通过补充矿质而填充。有趣的是，关于具有氟的(2)阳性对照，损伤深度没有改变。
经过各个处理后，还分析了补充矿质后的溶液中钙和磷浓度。溶液在10,000g离心2分钟，并分析上清液。使用钼酸方法测定磷浓度(“Shin-ban Bunseki KagakuJikken《新版分析化学实验》(New Edition Analyical Chemistry Experiment)(第一版)，313-314页，由Kagaku Dojin K.K.出版)，并用OCPC方法(由Wako Pure Chemicals生产使用“calcium C test Wako”试剂盒测定)测定钙浓度。结果显示于表1中。
表1Pi(mM) Ca(mM)对照 0.34 0.682ppm F0.41 0.73POs Na4％ 1.43.861％ 1.21.860.2％1.11.63POs Ca0.2％1.22.660.07％ 1.21.80
根据表1，发现通过加入磷酸化寡糖，溶解于溶液中的钙和磷的浓度仍高。
因此，钙试验表明通过加入磷酸化寡糖，溶解于溶液中的钙和磷的浓度仍高，结果，这些溶解的磷和钙可提供给龋齿部分并用于补充矿质。这种现象被认为发生在人的口腔中。
(实施例4)在实施例4中，一种补充矿质的简单试验系统用于澄清磷酸化寡糖对早期龋齿补充矿质的作用。
(补充矿质试验系统的步骤)为了以更加简单的方式检测补充矿质现象，更容易地产生补充矿质的条件被简化。在一个包含羟磷灰石的系统中，供给钙和磷用于结晶且可溶的钙被减少。相反，在一个不包含羟磷灰石的系统中，钙和磷不沉淀，以致其溶解度保持在高水平。基于这些事实，设计如下试验系统。
通过以如下次序混合下列物质制备500μl的溶液(1)50μl的200mM HEPES缓冲液(pH 7.0)；(2)200μl的去离子水或样品；(3)50μl的18mM KH2PO4溶液；(4)50μl的30mM氯化钙溶液；和(5)羟磷灰石悬浮液(5mg/ml)或去离子水。加入(3)后，使用0.1N氢氧化钾溶液调节溶液的pH。搅拌得到的溶液并在37℃培育1-7天。此后，溶液在12,000rpm离心3分钟。得到的上清液的钙浓度使用OCPC方法测定(如上述)。为此，使用Calcium test C Wako(编号272-21801)在570-nm处测定吸光度。可溶钙的百分比通过用加入的钙的浓度除以上清液的钙浓度乘以100获得。通过计算由去离子水获得的值和在(5)中加入羟磷灰石时得到的值之间的差数获得补充矿质的百分比。
(具有各种浓度的磷酸化寡糖对补充矿质的影响)上述简单试验系统用于在37℃培育具有各种浓度的磷酸化寡糖钠盐和磷酸化寡糖钙盐18小时或42小时。磷酸化寡糖钠盐和磷酸化寡糖钙盐补充矿质的结果分别显示于图3和4中(在图3和4中，垂直轴表示补充矿质的比率(％)，水平轴表示样品(％)，对照表示未加入样品；对于各个样品浓度，左边的条表示18小时处理，右边的条表示42小时处理)。磷酸化寡糖钠盐即使在低浓度下也改进了溶解加入的钙的能力(图3)。磷酸化寡糖钙盐具有低的溶解外部加入的钙盐的能力，并相反地释放额外的钙以改变溶液中的钙/磷比，以致于钙更容易沉淀并因此不能保持高的钙浓度(图4)。
因此，磷酸化寡糖钠盐能显示溶解作用而不改变系统中的钙/磷比。就磷酸化寡糖钙盐来说，认为需要与磷(磷酸盐、磷化合物等)同时供给以保持Ca/P比为1.67(P/Ca比＝0.6)。另外，加入的磷酸化寡糖钙盐的浓度需要对比值几乎没有影响。
(Ca/P浓度比＝1.67(P/Ca浓度比＝0.6)的磷酸化寡糖对补充矿质作用的影响)当使用磷酸化寡糖钙盐时，钙与磷浓度的比设定为1.67(P/Ca浓度比＝0.6)，设定浓度以从磷酸化寡糖中获得钙。设定钠盐以与磷酸化寡糖的浓度相匹配。浓度设定显示于以下表2中。
表2对照 POs Na
POs Ca
在上述简单试验系统中，37℃培育15小时。结果显示于图5中(垂直轴表示补充矿质的比率(％)，水平轴表示Ca浓度(mM)，填充的方形代表不含磷酸化寡糖盐的对照，菱形代表磷酸化寡糖钠盐(POs Na)，圆形代表磷酸化寡糖钙盐(POs Ca))。如图5所示，当Ca/P浓度比＝1.67(P/Ca浓度比＝0.6)不变且加入的钙的浓度提高时，在磷酸化寡糖钠盐和磷酸化寡糖钙盐之间获得相似的结果。当加入的钙盐是6mM或更多时，添加的磷酸化寡糖的作用降低。
(各种Ca/P比的磷酸化寡糖对补充矿质作用的影响)上述简单试验系统在37℃培养17.5小时或1周，期间钙与磷浓度比的改变显示于表3中(表3使用P/Ca)。
表3
该结果显示于图6A到6C中(垂直轴表示补充矿质的比率(％)，水平轴表示P/Ca)。图6A显示了不含磷酸化寡糖的对照的结果。方形代表17.5小时的处理，填充的菱形代表一周处理。图6B显示磷酸化寡糖钠盐的结果。三角形代表17.5小时处理，填充的三角形代表一周处理。图6C显示磷酸化寡糖钠盐的结果。圆形代表17.5小时处理，填充的圆形代表一周处理。如图6A到6C所示，当Ca固定到1.5mM并且磷浓度变化而改变P/Ca比时，认为磷酸化寡糖钠盐和磷酸化钙盐引起相对有效地补充矿质。根据这一结果，认为即使在高浓度磷的情况下，钙盐更加稳定。
(实施例5)实施例5显示磷酸化寡糖与其它抗龋齿药剂在补充矿质作用中的比较。作为抗龋齿的药剂，使用木糖、木糖醇、异蔗糖和palatinit。使用实施例3的简单系统检测补充矿质的效果。在该简单系统中，37℃培育8天。结果显示于图7A到7C中(垂直轴表示补充矿质的比率(％)，水平轴表示样品浓度(％))。图7A显示磷酸化寡糖盐的结果，其中填充的三角形代表钙盐，空的三角形代表钠盐。图7B显示木糖醇的结果，其中填充的圆形代表木糖醇，空的圆形代表木糖。图7C显示palatinit的结果，其中填充的方形代表palatinit，空的方形代表异蔗糖。根据图7A到7C，浓度低至约0.1％磷酸化寡糖显示了高的补充矿质的效果，而其它抗龋齿的药剂(木糖醇、异蔗糖、和palatinit)如以前所报道的，在浓度为20％时显示补充矿质的作用(日本公开出版物2000-128752号，日本公开出版物2000-247852号等)。对于木糖，在任何浓度补充矿质的百分比都低。
(实施例6)在实施例6中检测了磷酸化寡糖抑制脱矿化的效果。
制备具有如下组分的脱矿化溶液6.0mM氯化钙溶液；3.6mM磷酸二氢钾；2％乳酸盐溶液；和5mg/ml羟磷灰石溶液，pH 5.0。125μl的脱矿化溶液和125μl的具有终浓度为0.2％和2％磷酸化寡糖钠盐溶液混合并搅拌，随后在37℃培育2天。此后，混合物在12,000rpm离心3分钟。使用OCPC方法测定得到的上清液的钙浓度。加入的钙浓度和处理后钙的浓度。如果在有检测样品的情况下，加入的钙浓度和处理后钙的浓度之间的差异与对照(不含检测的样品)相比小，认为检测样品具有抑制脱矿化的作用。与不含磷酸化寡糖的对照(5mM)相比，0.2％和2％磷酸化寡糖钠盐溶液具有小的差异(3mM和2mM)。因此，认为磷酸化寡糖钠盐具有抑制脱矿化的作用。
(实施例7)实施例7显示了磷酸化寡糖与氟对于补充矿质作用的协同影响。
下面表4中描述的组合物用于检测在磷酸化寡糖存在或不存在的情况下补充矿质的效果。
表4
实施例中的简单系统用于检测补充矿质的效果。在简单系统中在37℃培育5天。此后，使用OCPC方法测定可溶钙的量。通过薄层层析(TLC)定性地证实磷酸化寡糖。用于TLC分析的条件如下硅胶平板(由Merck生产)；乙醇/去离子水/乙酸(＝70/30/2)；在室温展开一次；加入5μl的样品；1μl的1％磷酸化寡糖和1μl的1％的麦芽三糖作为标记。
TLC分析的结果显示于表8中。在图8中，各个泳道显示具有各种浓度(ppm)的氟，上方的点代表麦芽三糖，下方的点代表磷酸化寡糖。图9显示磷酸化寡糖与氟对补充矿质效果的协同作用(垂直轴表示补充矿质的比率(％)，水平轴表示氟的浓度(ppm)；在各个值中，左边的条表示不含磷酸化寡糖的对照，右边的条属于0.2％磷酸化寡糖的组)。氟是高度活泼的卤素。检测了氟对磷酸化寡糖和钙的定量的作用。在试验条件下，氟加入的影响似乎是微不足道的(图8)。氟的加入改变了Ga/P的浓度比的平衡，以致不溶解性下降。因此，由于氟浓度的提高补充矿质的比率下降。然而，当加入0.2％磷酸化寡糖钠盐时，补充矿质的效果趋于提高，因此，可证实显著的协同作用(图9)。
(实施例8)实施例8显示与口香糖混合的磷酸化寡糖以及进入人口腔的磷酸化寡糖的洗提。
制备显示于表5中的含有磷酸化寡糖钙盐的片状口香糖(平板样口香糖)(钙含量是3.2％)(片状口香糖具有约3.2g的重量)。
表5
3.2g/片状口香糖当咀嚼口香糖时，随时间洗提进入口腔的钙盐的量通过薄层层析(TLC)分析。用于TLC的条件如下展开平板是一个硅胶平板；展开洗提液是乙醇/去离子水/乙酸＝70/30/2；展开温度是室温，展开进行一次；点样的量是3μl；通过向平板喷洒检测溶液(硫酸/乙醇＝1∶1)进行检测，随后在130℃处理3分钟，借此点显出颜色。
图10显示具有标准溶液浓度的磷酸化寡糖的TLC分析结果。各个泳道显示具有各种浓度的磷酸化寡糖的洗提(表示左边为1％木糖醇作为对照和右边为1％麦芽三糖(G3))。下方的点代表磷酸化寡糖，上方的点代表木糖醇和麦芽三糖。图11显示当咀嚼含磷酸化寡糖的口香糖时随时间的洗提量。各泳通表示随咀嚼时间的洗提(表示左边为1％磷酸化寡糖作为对照，右边为1％木糖醇和麦芽三糖(G3)。下方的点代表磷酸化寡糖，上方的点代表木糖醇和麦芽三糖。磷酸化寡糖没有用唾液淀粉酶水解。根据这些图，将理解咀嚼开始后约10分钟，相对高浓度的磷酸化寡糖存在于口腔中，20分钟后，磷酸化寡糖保留约0.25％浓度。
(实施例9)实施例9显示磷酸化寡糖对蔗糖发酵的影响。
变异链球菌菌株8148在37℃培养于1,000ml的脑心浸液培养基(由DIFCOCorporation生产)14小时。此后，通过在6,000rpm离心20分钟收集细菌。细菌用磷酸缓冲盐溶液(PBS，pH 7.2)洗涤，并于相同的PBS中悬浮至40％(v/v)。为了测定pH，反应混合物(250μl)由125μl的40％细菌细胞悬浮液、62.5μl的80mM蔗糖和62.5μl的含有各种寡糖的水溶液(5％磷酸化寡糖钠盐和磷酸化寡糖钙盐)组成。在37℃培养时，反应混合物的pH用pH仪(由Toa Denpa生产)连续测定。
当0.684％蔗糖或0.684％葡萄糖加入含有变异链球菌8158菌株的20％细菌细胞悬浮液，5分钟内反应液的pH下降至5.0以下，10分钟后下降至4.0。当5％磷酸化寡糖(PO-1和PO-2)同时存在时，在两种情况下pH的下降被明显抑制(数据未显示)。当加入5％磷酸化寡糖钠盐或磷酸化寡糖钙盐时，由于0.684％的蔗糖的发酵引起的pH下降被有效抑制(数据未显示)。
(实施例10)在实施例10中，制备磷酸化寡糖的糖醇。
10g含有每分子具有一个磷酸基团的磷酸化寡糖的PO-1部分和具有2个磷酸基团的磷酸化寡糖的PO-2部分溶解于100ml的蒸馏水中。用1N氢氧化钠溶液将溶液调整为弱碱溶液(约pH 8)。向100ml获得的溶液加入30ml的3％氢氧化硼钠溶液。使混合物在40℃放置1小时以使磷酸化寡糖还原。这样，氢被加入磷酸化寡糖的还原末端。用1N盐酸溶液调节加入氢的溶液到pH 7.5。反应终止后，溶液使用0.22μm膜进行透析。获得的溶液使用电透析仪(Micro acilyser)G3，AC210-400膜由AsahiKasei Corporation生产)脱盐，然后使用强阳离子交换树脂(Dowex 50w 20-50 MESH，H-型由Nisshin Kasei生产)进行离子交换，由此获得pH 2.7的糖溶液。获得的溶液用1N氢氧化钠溶液或氢氧化钙溶液中和，随后冻干，从而制备磷酸化寡糖钠或钙盐。
(实施例11)在实施例11中，制备硫酸软骨素寡糖(不饱和双糖(二聚体))。
4.8g的硫酸软骨素钠(C型由Katayama Kagaku生产)溶解于500ml的蒸馏水中(pH 6.0)。15U软骨素酶ACII(衍生自金黄节杆菌，由Seikagaku Kogyo生产)加入得到的溶液并使之在37℃反应23小时。在沸水浴中终止反应，随后如实施例10中所描述的脱盐。这样，制备了硫酸软骨素寡糖钠或钙盐。
(实施例12)在实施例12中，检测了各种物质的补充矿质的作用。
使用实施例4的简单补充矿质试验系统。关于样品，使用显示于以下表6中的物质。制备所有物质为0.1％的终浓度。
表6编号 样品1POs Na2PO-2 Na3POsH Na4G35PO-2H Na6Glc-6-P7Ser-P8硫酸软骨素C9低聚半乳糖醛酸10 二聚体Na11 D.W.
在上述表6中，编号1的POs Na表示磷酸化寡糖(PO-1部分)钠盐，编号2的PO-2Na表示磷酸化寡糖(PO-2部分)钠盐，编号3的POsH Na表示磷酸化寡糖(PO-1部分)糖醇钠盐，编号4的PO-2H Na表示磷酸化寡糖(PO-2部分)糖醇钠盐，编号5的G3表示麦芽三糖(葡萄糖三糖)，编号6的Glc-6-P表示葡萄糖-6-磷酸，编号7的Ser-P表示磷酸丝氨酸，编号8表示硫酸软骨素C，编号9表示低聚半乳糖醛酸，编号10表示硫酸软骨素的不饱和双糖(在表6和图12中，二聚体钠)，和编号11的D.W.表示去离子水。
结果显示于图12中(垂直轴表示补充矿质的比率(％)，水平轴表示样品物质)。图中，具有比去离子水补充矿质的比率高的物质被判定具有补充矿质的作用。磷酸化寡糖醇钠盐、葡萄糖-6-磷酸、硫酸软骨素C钠盐，和硫酸软骨素不饱和双糖钠盐显示补充矿质的作用，其作用与磷酸化寡糖钠盐一样好或优于磷酸化寡糖钠盐。
(实施例13)在实施例13中，检测了各种物质的补充矿质的作用。
使用实施例4的简单补充矿质试验系统。关于样品，使用显示于表7中的物质。
表7
表7中，编号1的POs Na表示磷酸化寡糖(PO-1部分)钠盐(0.2％的终浓度)，编号2的POs Na表示磷酸化寡糖(PO-1部分)钠盐(2.0％的终浓度)，编号3表示异蔗糖(20％的终浓度)，编号4表示异蔗糖(20％的终浓度，编号5表示木糖醇(Wako 244-0052)(2.0％的终浓度)，编号6表示木糖醇(Wako 244-0052)(20％的终浓度)，编号7表示海藻糖(Wako 02252)(2％的终浓度)，编号8表示海藻糖(Wako 02252)(20％的终浓度)，编号9表示山梨醇(Katayama 28-4770)(2％的终浓度)，编号10表示山梨醇(Katayama 28-4770)(20％的终浓度)，编号11的G3表示麦芽三糖(2％的终浓度)，编号12的D.W.表示去离子水(对照)，编号13表示有机酸(酒石酸)(2％的终浓度)，编号14表示有机酸(酒石酸)(1.4％的终浓度)，和编号15表示硫酸葡聚糖(0.2％的终浓度)。
结果显示于图13中(垂直轴表示补充矿质比率(％)，水平轴表示样品物质)。在包括木糖醇、异蔗糖、和山梨醇的20％添加组中，证实补充矿质的作用与以前报道的一致(如上述)。而且，与硫酸软骨素相似，证实硫酸皮肤素具有补充矿质的作用。有机酸与磷酸化寡糖相似也是有效的。
(实施例14)在实施例14中，在人工口腔装置中检测预防龋齿的效果。
表兄链球菌菌株6715培养物(预培养于脑心浸液培养基(由DIFCO Corporation生产))，心浸液培养基(由DIFCO Corporation生产)，和样品溶液(各个样品在检测过程中冷却)，以6ml/小时/管的速度分别提供给保存于恒温浴(37℃)的牛牙齿(约5×5mm)。随时间测定牙齿表面的pH。结果显示于图14中(垂直轴表示pH的改变，水平轴表示时滞；圆形代表添加仅1％糖(GF)，填充的三角形代表添加1％GF+5％磷酸化寡糖钙盐(POs Ca))。16小时后，齿斑从牙齿上刮去，在500nm处测定浑浊度。而且，通过苯酚-硫酸方法测定形成的水不溶的葡聚糖(WIG)的量。使用硬度计测定牙齿的硬度。得到此硬度与未处理的牙齿的硬度之间的差值(ΔH)。结果显示于表8中。
表8
很明显在1％GF(糖)的情况下，产生有机酸，约10分钟后，pH为5.6或更少，该有机酸保持在齿斑中。齿斑充分地形成，牙齿遭受脱矿质并变脆。相反，在含有1％GF和5％磷酸化寡糖的溶液中，没有形成齿斑，并且pH没有降低。即，防止了龋齿细菌侵入牙齿，以致于齿斑形成受到阻抑，并抑制了牙齿的脱矿化。因此，牙齿的硬度没有改变。根据这一结果，清楚地发现磷酸化寡糖具有预防龋齿的作用。认为这一现象类似地发生于人的口腔中。
(实施例15)在实施例15中，从各种淀粉中制备磷酸化寡糖。
用于本实施例的淀粉取自水稻、淀粉(品牌名称Better FriendTM由ShimadaKagaku生产)和木薯淀粉(Sanwa Cornstarch Co.，Ltd.)。
100g的淀粉粉末加入800-1000ml水中。向得到的溶液中加入50μl衍生自细菌地衣芽孢杆菌(购自Fukutamirase，来自Hankyu Industries，1％)的5000U/ml的淀粉液化α-淀粉酶(BLA)。该溶液在50℃水浴中凝胶化48小时。另外，50μl的5000U/mlBLA(Fukutamirase，来自Hankyu Industries，1％)、50μl的200U/ml支链淀粉酶(Promozyme由Novo Nordisk生产)、和50μl的葡糖淀粉酶(416U/ml)(购自Toyobo)加入到凝胶化的淀粉中，随后在50℃培养48小时。获得的混合物在8,000rpm离心20分钟。将上清液应用于用10mM乙酸盐缓冲液(pH 4.5)平衡的阴离子交换树脂(Chitopearl BCW 2501由Fuji Spinning Co.，Ltd.生产)。用相同的缓冲液彻底洗涤柱以除去中性糖类，随后用含有0.5M氯化钠的相同缓冲液洗提。各个洗提的部分用蒸发器浓缩，随后去盐和冻干。由此获得磷酸化寡糖。
这样获得的磷酸化寡糖再次用于由20mM乙酸盐缓冲液(pH 4.5)平衡的阴离子交换树脂柱(Chitopearl BCW2501)。用相同的缓冲液彻底洗涤柱以除去中性糖类。首先用含有0.15M氯化钠的相同缓冲液洗提柱，接着用含有0.5M氯化钠的相同缓冲液洗提，由此收集部分。收集到的部分去盐并冻干。根据上述用于确定结构的方法分析这些部分，表明在从0.15m氯化钠洗提的部分(PO-1部分)获得的磷酸化寡糖中，一个磷酸基团与含α-1，4键的3-5个葡萄糖的葡聚糖连接；在从用0.5M氯化钠洗提的部分(PO-2部分)中获得的磷酸化寡糖中，两个或更多的磷酸基团与含α-1，4键的2-8个葡萄糖的葡聚糖结合。磷酸化寡糖的结构分析如实施例1中描述的进行。
(实施例16)实施例16显示含有磷酸化寡糖的口香糖具有促进早期龋齿中釉质补充矿质的作用。
用通常使用的方法生产两种片状口香糖(约1.5g/片)含有衍生自马铃薯淀粉的2.5％(平均含量)的POs Ca的无糖口香糖(含有45％的木糖醇)和不含POs Ca的无糖口香糖(含有47.5％的木糖醇)。所有的试验试剂都是保证试剂。各个物质的含量是关于口香糖总重量的比例。
关于牙齿材料，使用牛牙齿的冠釉质。使用菱形锯(由LUXO生产)将釉质切成具有标准大小侧面的块(7×7×3mm)。这些釉质块(6个样品)包埋于自聚的树脂，(UNIFAST Trad，由GC生产)，形成具有大小为15×50mm和厚度为7mm的平板。此后，用湿润的研磨砂纸(粒度800)研磨平板的表面以暴露出平坦而新鲜的釉质。另一方面，牙齿的牙质侧预先包埋于印模膏(由GC生产)。每一个这样制备的釉质块包埋平板在37℃浸没于100ml的0.1M乳酸凝胶(6wt％羧甲基纤维素，pH 5.0)4周，由此人为地产生龋齿。
17名健康的受检者参加了一项测试，测试中受检者咀嚼两种含有POs Ca的口香糖或不含POs Ca的口香糖颗粒(3.0g)20分钟。测试中，没有告知受检者口香糖的种类。在口香糖咀嚼开始后到1分钟后、1分钟后到3分钟后、3分钟后到6分钟后、6分钟后到10分钟后，以及10分钟后到20分钟后的时间阶段中，使用塑料漏斗从受检者收集唾液到10ml的塑料试管中。收集后立即测定唾液的量和pH。其后，用蒸馏水稀释唾液上清液10倍，随后用0.45μm滤器(由Millipore生产)过滤。使用OCPC方法(Calcium Ctest Wako；由Wake Pure Chemicals生产)和钼酸方法定量滤液中Ca和无机P的含量。
12名健康的受检者参加了一项测试，测试中受检者咀嚼两种片状的含POs Ca的口香糖或不含POs Ca的口香糖(3.0g)20分钟。测试中，没有告知受检者口香糖的种类。使用塑料漏斗从受检者收集在20分钟咀嚼的第一个10分钟的过程中(唾液A)和第二个10分钟的过程中(唾液B)的唾液放入50ml塑料试管中。收集后立即测定唾液的量和pH。测定后，立即将7ml的唾液倾入塑料容器(10×30×60mm)中，在该容器中事先放置一个具有人造龋齿的包釉质块包埋平板。此量为釉质块包埋平板可充分浸没于唾液中的量。平板浸没于唾液A中10分钟后，该平板浸没于唾液B中10分钟。此后，移去平板，用蒸馏水彻底洗涤平板表面。该浸没操作是在37℃进行，并一天连续重复4次。操作后釉质块包埋平板日常保存于湿度为100％的凉爽环境中。使用每天收集的人唾液连续4天进行测试。对于测试中使用的唾液，使用上清液的部分并用蒸馏水稀释10倍，随后用0.45μm滤器(由Millipore生产)过滤。使用上述方法每天测定滤液的Ca和无机P。
在人的唾液中浸没后，使用坚硬组织切割器(Isomet，Buhler，USA)将各个牙齿釉质切割成为具有约500μm厚度的切片。用湿润的研磨砂纸(粒度800)研磨各个切片到约200μm厚度。各个切片进行显微放射照相(PW-1830，Philips，荷兰)。用于显微放射照相的条件是管电压为25kv；电流是25mA；管和受检者之间的距离是370mm。此后，使用Inaba等的图象定量方法(Eur.J.Oral.Sci.10574-84，1997)测定损伤深度(Ld，μm)和矿物质流失值ΔZ(体积％·μm)。
17名健康的受检者咀嚼2种含POs Ca的口香糖或不含POs Ca的口香糖颗粒(3.0g)20分钟。在这种情况下，唾液的量(图15水平轴代表口香糖咀嚼时间垂直轴代表唾液量(ml))、唾液的pH(图16水平轴代表口香糖咀嚼时间，垂直轴代表pH)、唾液中Ca含量(图18水平轴代表口香糖咀嚼时间，垂直轴代表Ca量(mg))，和唾液中P含量(图17水平轴代表口香糖咀嚼时间，垂直轴代表磷量(mg))随时间而测定，其中数值从开始由整合值表示。而且，计算唾液的Ca/P比的变化(图19水平轴代表口香糖咀嚼时间，垂直轴代表Ca/P比)。在各个图中，含POs Ca的口香糖(+POs Ca口香糖)和不含POs Ca的口香糖(-POs Ca口香糖)分别由方形和菱形表示。
结果，分泌的唾液的量(图15)、pH变化(图16)和P含量的变化(图17)在口香糖类型中没有改变到统计学上的显著水平。在20分钟的口香糖咀嚼中，分泌约30ml的唾液，5分钟后唾液的pH从开始咀嚼口香糖时的7.0提高到7.5。通过口香糖咀嚼分泌的唾液中P的含量约5mg，与钙含量相比它足以用于补充矿质。相反，清楚地发现在含有POs Ca的口香糖的情况下，咀嚼开始20分钟后溶解于唾液中的Ca量约4倍于咀嚼不含POs Ca的口香糖的情况(图18)。由于一定量的P本来存在于唾液中(图16)，在含有POs Ca的口香糖情况下，Ca/P比也明显高(p＜0.001)(图19)。在上述分析结果中，在女性和男性受检者之间没有发现明显差异。
图9显示了从咀嚼两种含有POs Ca的口香糖或不含POs Ca的口香糖颗粒(3.0g)20分钟的12名健康受检者中收集的唾液A和唾液B的分析结果。
表9唾液体积、pH和矿物质含量的比较口香糖种类 唾液A 唾液B唾液(ml) +POs Ca 20.34±4.139.35±3.24-POs Ca 20.74±4.439.65±3.35Ca(mM)+POs Ca 6.2±2.44**1.72±0.53*-POs Ca 1.69±0.41 1.51±0.42P(mM) +POs Ca 5.62±1.41 6.22±1.31-POs Ca 6.15±1.35 6.49±1.15Ca/P +POs Ca 1.12±0.31**0.28±0.08-POs Ca 0.28±0.08 0.23±0.06平均值±标准差，*p＜0.05，**p＜0.001，n＝12在两种口香糖中，唾液A的量约两倍于唾液B的量。在唾液A中，不含POs Ca的口香糖和含有POs Ca的口香糖之间Ca含量有明显差异。然而，在唾液B中，这种差异。对于P含量，在两种口香糖之间以及在唾液A和B之间没有鉴别到差异。因此，在唾液A中，当咀嚼含有POs Ca的口香糖时，其Ca/P比约4倍于当咀嚼不含POs Ca的口香糖时的Ca/P比。
接着，对于12个受检者的被处理牙齿的补充矿质促进效果的评估结果以损伤深度和矿物质流失值显示于图20A(垂直轴表示损伤深度(Ld，μm))和图20B(垂直轴表示矿物质流失值ΔZ(v％·μm))。在两个图中，水平轴以空白、含有POs Ca的口香糖、和不含POs Ca的口香糖的次序表示。根据损伤深度(Ld)和矿物质流失值(ΔZ)，观察到在含有POs Ca的口香糖的情况下比不含POs Ca的口香糖的情况下脱矿质的牙齿釉质的恢复明显。即，在含有POs Ca的口香糖的咀嚼组中，获得了补充矿质的促进效果(p＜0.001)。
(实施例17)实施例17显示在人的口腔中，含有磷酸化寡糖的口香糖对釉质的补充矿质的促进效果。
与实施例13相似，制备了两种片状的口香糖(约1.5g/片)，即含有POs Ca口香糖和不含POs Ca无糖口香糖。所有使用的试验试剂是保证试剂。
从牛切牙的齿冠部的釉质部分制备釉质片(直径5mm；厚度1.5mm)。颊面的头部表面用湿润的研磨砂纸(粒度800)磨光以暴露出新鲜而平刨的釉质。这样制备的釉质片在37℃浸没于100ml的0.1M乳酸溶液(pH 5.0)3天以产生人造龋齿。脱矿质后，三个釉质片附着在一个可移动的腭板的上部右侧磨牙的腭区。
12名健康的受检者(6名男性和6名女性；平均年龄＝21岁)一次咀嚼2片含有POsCa的口香糖、不含POs Ca的口香糖，或蔗糖口香糖(含62％的蔗糖)(1粒约1.5g)20分钟。在这一测试中，每个受检者咀嚼其中的一种口香糖一天4次。没有告知负责该测试的人以及受检者正在咀嚼的口香糖的类型。对于每一种口香糖，该测试一直进行2周。在各个测试之间有一周的间隔时间。在口香糖咀嚼的过程中或之后，腭板被附着20分钟。在测试期间，受检者没有使用氟剂并且分离的腭板在100％湿度下储存，避免干燥。
1、2和4周后，测试的附着的牙齿从各个受检者的腭板上除去。从各个釉质上切厚度约为200μm的切片。各个切片进行显微放射照相(PW-1830，Philips，荷兰)。显微放射照相的条件如下管电压25kV；管电流25mA；管和受检者之间的距离为370mm。此后，用Inaba等的图象定量方法测定损伤深度(ld，μm)(Eur.J.Oral.Sci.10574-84，1997)。Ld的值根据矿物质分布图作为从牙齿头部表面到损伤位置之间的距离而确定，在损伤的位置中矿物质含量达到健康组织矿物质含量的95％水平。补充矿质的比率计算为与脱矿质后初始ld值有关的ld值的缩减比。补充矿质的结果显示于图21。在图21中，水平轴以周1、周2和周4的次序表示蔗糖口香糖组(Suc)，不含POs Ca的口香糖组(Xyl)，和含有POs Ca的口香糖组(POs)。垂直轴表示补充矿质的比率(％)。
在含有POs Ca的口香糖组(POs)中，周1、周2和周4时补充矿质的比率分别为67％、54％和76％。不含POs Ca的口香糖组(Xyl)是12到23％，该值低于含有POsCa的口香糖组。蔗糖口香糖组(Suc)截止到周2显示正的补充矿质的比率，而截止到周4最终达到负值，表明脱矿质。
人的口腔内评估显示在含有POs Ca的口香糖的情况下比在不含POs Ca的口香糖和蔗糖口香糖的情况下具有较高的补充矿质促进效果。具体地说，所有的12名受检者咀嚼各种口香糖各两周并在含有POs Ca的口香糖的情况下获得显著的结果。因此，通过人的口腔内评估证实向口香糖中加入POs Ca导致高水平的补充矿质促进效果。同时，在口腔中还证实通过在基本上每天的基础上食用含有POs Ca的口香糖产品，增强早期龋齿补充矿质的作用，因此非常有效地预防龋齿。
(实施例18)在实施例18中，分析了当摄入含有磷酸化寡糖的糖果时唾液的成分。
制备含有如图10中描述的成分的糖果。
表10糖果 (％按重量计)Palatinit 95POs Ca 2.94调味剂 2.064个健康的成人受检者食用糖果(4.7g)并收集分泌的唾液。糖果放入口中后在口腔中停留约10分钟。在如下4个时间段收集唾液(i)0-1分钟；(ii)1-3分钟；(iii)3-6分钟；和(iv)6-10分钟。通过漏斗收集分泌的唾液进入15ml的试管。收集后，立即搅拌分泌的唾液，并测定唾液的pH和含量。结果显示于图22和23中。在图22中，水平轴表示摄入时间(min)，垂直轴表示pH。口腔中唾液的pH恒定为7。图23中，水平轴表示摄入时间(min)，垂直轴表示唾液的量(ml/min)。分泌的唾液的量在摄入时间过程中基本上恒定。
而后，1800μl的唾液放入4个离心管中。200μl的1N HCl溶液加入各个管中。混合液充分混合，随后在10,000xg离心3分钟，并使之通过0.5μm膜。用OCPC方法测定10μl获得的上清液以确定钙含量。使用钼方法测定50μl的上清液以确定磷含量。钙和磷含量显示于图24中。在图24中，水平轴表示摄入时间(min)，左边的垂直轴表示钙或磷含量(mM)，右边的垂直轴表示Ca/P比。在摄入时间过程中，钙和磷含量基本恒定(保持在约0.6)。
(实施例19)实施例19中，制备含有磷酸化寡糖的糖果和软糖以确定补充矿质促进效果。
依据通常使用的方法制备表11中所显示的含有这些成分的糖果(4.7g/粒)和软糖(4.0g/粒)。
表11糖果(％按重量计)Palatinit 95POs-Ca 2.94调味剂 2.06软糖(％按重量计)Palatinit 47.5木糖醇 47.5POs-Ca 2.94调味剂 2.0610ml蒸馏水加入各个上述糖果或软糖中，并在沸水浴中溶解。使用微型pH仪测定得到的提取溶液的pH。此后，提取溶液在10,000xg离心3分钟并通过0.5μm膜。用OCPC方法测定10μl获得的上清液以确定钙浓度。使用钒钼酸方法测定50μl的上清液溶液以确定无机磷浓度。结果显示于表12中。
表12软糖和糖果的提取物中Ca和P的矿物质含量产物Ca(mM) P(mM) Ca/P软糖3.88 1.822.13糖果5.18 2.142.42而且，基于表12的结果分析，调整2倍和10倍稀释的提取液具有钙和磷的含量显示于表13中。此后，评估对羟磷灰石的补充矿质促进效果。
表13用于促进补充矿质作用的评估系统3.0mM CaCl2溶液1.8mM KH2PO4溶液20mM HEPES缓冲液(pH 7.0)(0.5mg/ml羟磷灰石)结果显示于图24中。在图24中，水平轴表示摄入时间(min)，左边的垂直轴表示钙或磷含量(mM)，右边的垂直轴表示Ca/P比。
在糖果或软糖中，10倍稀释的溶液显示了高水平的补充矿质促进效果。
(实施例20)用通常使用的方法制备含有显示于表14中的组合物的洁牙剂。
表14
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例21)用通常使用的方法制备含有显示于表15中的组合物的洁牙剂。
表15
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例22)用通常使用的方法制备含有显示于表16中的组合物的洁牙剂。
表16
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例23)用通常使用的方法制备含有显示于表17中的组合物的洁牙剂。
表17
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例24)用通常使用的方法制备含有显示于表18中的组合物的洁牙剂。
表18
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例25)用通常使用的方法制备含有显示于表19中的组合物的洁牙剂。
表19
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例26)用通常使用的方法制备含有显示于表20中的组合物的洁牙剂。
表20
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例27)用通常使用的方法制备含有显示于表21中的组合物的洁牙剂。除1N氢氧化锌溶液用于中和外，POs Zn以与实施例2中相同的方式制备。
表21
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例28)用通常使用的方法制备含有显示于表22中的组合物的洁牙剂。
表22
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例29)用通常使用的方法制备含有显示于表23中的组合物的漱口剂。
表23
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例30)用通常使用的方法制备含有显示于表24中的组合物的漱口剂。
表24
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例31)用通常使用的方法制备含有显示于表25中的组合物的漱口剂。
表25
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例32)用通常使用的方法制备含有显示于表26中的组合物的漱口剂。
表26
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例33)用通常使用的方法制备含有显示于表27中的组合物的漱口剂。除1N氢氧化锌溶液用于中和外，POs Zn以与实施例2中相同的方式制备。
表27
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例34)用通常使用的方法制备含有显示于表28中的组合物的口腔软膏。
表28
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例35)用通常使用的方法制备含有显示于表29中的组合物的口腔软膏。
表29
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例36)用通常使用的方法制备含有显示于表30中的组合物的洁牙剂。
表30
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例37)用通常使用的方法制备含有显示于表31中的组合物的洁牙剂。
表31
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例38)用通常使用的方法制备含有显示于表32中的组合物的洁牙剂。
表32
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例39)用通常使用的方法制备含有显示于表32中的组合物的洁牙剂。
表33
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例40)用通常使用的方法制备含有显示于表34中的组合物的洁牙剂。
表34
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例41)用通常使用的方法制备含有显示于表35中的组合物的洁牙剂。
表35
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例42)用通常使用的方法制备含有显示于表36中的组合物的洁牙剂。
表36
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例43)用通常使用的方法制备含有显示于表37中的组合物的洁牙剂。
表37
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例44)用通常使用的方法制备含有显示于表38中的组合物的洁牙剂。
表38
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例45)用通常使用的方法制备含有显示于表39中的组合物的漱口剂。
表39
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例46)用通常使用的方法制备含有显示于表40中的组合物的漱口剂。
表40
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例47)用通常使用的方法制备含有显示于表41中的组合物的漱口剂。
表41
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例48)用通常使用的方法制备含有显示于表42中的组合物的漱口剂。
表42
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例49)用通常使用的方法制备含有显示于表43中的组合物的漱口剂。
表43
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例50)用通常使用的方法制备含有显示于表44中的组合物的口腔软膏。
表44
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例51)用通常使用的方法制备含有显示于表45中的组合物的口腔软膏。
表45
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例52)用通常使用的方法制备含有显示于表46中的组合物的洁牙剂。
表46
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例53)用通常使用的方法制备含有显示于表47中的组合物的洁牙剂。
表47
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例54)用通常使用的方法制备含有显示于表48中的组合物的洁牙剂。
表48
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例55)用通常使用的方法制备含有显示于表49中的组合物的洁牙剂。
表49
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例56)用通常使用的方法制备含有显示于表50中的组合物的洁牙剂。
表50
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例57)用通常使用的方法制备含有显示于表51中的组合物的洁牙剂。
表51
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例58)用通常使用的方法制备含有显示于表52中的组合物的洁牙剂。
表52
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例59)用通常使用的方法制备含有显示于表53中的组合物的洁牙剂。
表53
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例60)用通常使用的方法制备含有显示于表54中的组合物的洁牙剂。
表54
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例61)用通常使用的方法制备含有显示于表55中的组合物的漱口剂。
表55
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例62)用通常使用的方法制备含有显示于表56中的组合物的漱口剂。
表56
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例63)用通常使用的方法制备含有显示于表57中的组合物的漱口剂。
表57
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例64)用通常使用的方法制备含有显示于表58中的组合物的漱口剂。
表58
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例65)用通常使用的方法制备含有显示于表59中的组合物的漱口剂。
表59
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例66)用通常使用的方法制备含有显示于表60中的组合物的口腔软膏。
表60
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例67)用通常使用的方法制备含有显示于表61中的组合物的口腔软膏。
表61
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例68)用通常使用的方法制备含有显示于表62中的组合物的洁牙剂。
表62
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例69)用通常使用的方法制备含有显示于表63中的组合物的洁牙剂。
表63
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例70)用通常使用的方法制备含有显示于表64中的组合物的洁牙剂。
表64
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例71)用通常使用的方法制备含有显示于表65中的组合物的洁牙剂。
表65
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例72)用通常使用的方法制备含有显示于表66中的组合物的洁牙剂。
表66
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例73)用通常使用的方法制备含有显示于表67中的组合物的洁牙剂。
表67
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例74)用通常使用的方法制备含有显示于表68中的组合物的洁牙剂。
表68
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例75)用通常使用的方法制备含有显示于表69中的组合物的洁牙剂。
表69
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例76)
用通常使用的方法制备含有显示于表70中的组合物的洁牙剂。
表70
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例77)用通常使用的方法制备含有显示于表71中的组合物的漱口剂。
表71
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例78)用通常使用的方法制备含有显示于表72中的组合物的漱口剂。
表72
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例79)用通常使用的方法制备含有显示于表73中的组合物的漱口剂。
表73
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例80)用通常使用的方法制备含有显示于表74中的组合物的漱口剂。
表74
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例81)用通常使用的方法制备含有显示于表75中的组合物的漱口剂。
表75
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例82)用通常使用的方法制备含有显示于表76中的组合物的口腔软膏。
表76
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例83)用通常使用的方法制备含有显示于表77中的组合物的口腔软膏。
表77
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例84)用通常使用的方法制备含有显示于表78中的组合物的洁牙剂。
表78
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例85)用通常使用的方法制备含有显示于表79中的组合物的洁牙剂。
表79
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例86)用通常使用的方法制备含有显示于表80中的组合物的洁牙剂。
表80
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例87)用通常使用的方法制备含有显示于表81中的组合物的洁牙剂。
表81
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例88)用通常使用的方法制备含有显示于表82中的组合物的洁牙剂。
表82
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例89)用通常使用的方法制备含有显示于表83中的组合物的洁牙剂。
表83
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例90)用通常使用的方法制备含有显示于表84中的组合物的洁牙剂。
表84
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例91)用通常使用的方法制备含有显示于表85中的组合物的洁牙剂。
表85
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例92)用通常使用的方法制备含有显示于表86中的组合物的洁牙剂。
表86
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例93)用通常使用的方法制备含有显示于表87中的组合物的漱口剂。
表87
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例94)用通常使用的方法制备含有显示于表88中的组合物的漱口剂。
表88
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例95)用通常使用的方法制备含有显示于表89中的组合物的漱口剂。
表89
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例96)用通常使用的方法制备含有显示于表90中的组合物的漱口剂。
表90
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例97)用通常使用的方法制备含有显示于表91中的组合物的漱口剂。
表91
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例98)用通常使用的方法制备含有显示于表92中的组合物的口腔软膏。
表92
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例99)用通常使用的方法制备含有显示于表93中的组合物的口腔软膏。
表93
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例100)用通常使用的方法制备含有显示于表94中的组合物的洁牙剂。
表94
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例101)用通常使用的方法制备含有显示于表95中的组合物的洁牙剂。
表95
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例102)用通常使用的方法制备含有显示于表96中的组合物的洁牙剂。
表96
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例103)用通常使用的方法制备含有显示于表97中的组合物的洁牙剂。
表97
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例104)用通常使用的方法制备含有显示于表98中的组合物的洁牙剂。
表98
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例105)用通常使用的方法制备含有显示于表99中的组合物的洁牙剂。
表99
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例106)用通常使用的方法制备含有显示于表100中的组合物的洁牙剂。
表100
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例107)用通常使用的方法制备含有显示于表101中的组合物的洁牙剂。
表101
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例108)用通常使用的方法制备含有显示于表102中的组合物的洁牙剂。
表102
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例109)用通常使用的方法制备含有显示于表103中的组合物的漱口剂。
表103
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例110)用通常使用的方法制备含有显示于表104中的组合物的漱口剂。
表104
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例111)用通常使用的方法制备含有显示于表105中的组合物的漱口剂。
表105
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例112)用通常使用的方法制备含有显示于表106中的组合物的漱口剂。
表106
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例113)用通常使用的方法制备含有显示于表107中的组合物的漱口剂。
表107
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例114)用通常使用的方法制备含有显示于表108中的组合物的口腔软膏。
表108
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例115)用通常使用的方法制备含有显示于表109中的组合物的口腔软膏。
表109
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例116)用通常使用的方法制备含有显示于表110中的组合物的人造唾液。
表110(mg)氯化钠 42.2氯化钾 60氯化钙 7.3氯化镁 2.6磷酸二氢钾 17.1POs Ca 20总量(ml) 50该人造唾液具有极好的补充矿质促进效果和使口腔中的pH恢复到中性的能力。
(实施例117)用通常使用的方法制备含有显示于表111中的组合物的人造唾液。
表111(mg)氯化钠 42.2氯化钾 60POs Ca 10氯化镁 2.6磷酸二氢钾 17.1总量(ml) 50该人造唾液具有极好的补充矿质促进效果和使口腔中的pH恢复到中性的能力。
人造唾液可类似地通过加入除POs Ca和POs Na外的缓冲剂制备。
工业适用性如上所述，本发明提供了通过牙齿补充矿质等减少龋齿的发生的膳食组合物和口腔组合物。
权利要求
1.一种具有抗龋齿功能的膳食组合物，其特征在于，所述组合物包括在口腔中具有pH缓冲作用的缓冲剂。
2.如权利要求1所述的膳食组合物，其特征在于，所述缓冲剂是磷酸化寡糖或其糖醇。
3.如权利要求1所述的膳食组合物，其特征在于，所述缓冲剂选自磷酸化寡糖或其糖醇，其中磷酸化寡糖是由具有α-1，4键的3-5个葡萄糖组成的葡聚糖，其中一个磷酸基团与葡聚糖连接，或是由具有α-1，4键的2-8个葡萄糖组成的葡聚糖，其中两个磷酸基团与葡聚糖连接；硫酸软骨素；硫酸软骨素寡糖；葡萄糖-6-磷酸；寡半乳糖醛酸；和酒石酸。
4.如权利要求1所述的膳食组合物，其特征在于，所述缓冲剂是磷酸化寡糖或其糖醇，其中磷酸化寡糖是由具有α-1，4键的3-5个葡萄糖组成的葡聚糖，其中一个磷酸基团与葡聚糖连接，或是由具有α-1，4键的2-8个葡萄糖组成的葡聚糖，其中两个磷酸基团与葡聚糖连接。
5.如权利要求1所述的膳食组合物，其特征在于，所述缓冲剂是呈碱金属盐、碱土金属盐、或铁盐的形式。
6.如权利要求5所述的膳食组合物，其特征在于，所述缓冲剂是呈钠盐或钙盐的形式。
7.如权利要求1所述的膳食组合物，其特征在于，所述组合物进一步包含有效量的氟或用于抗龋齿的含氟物质。
8.一种具有抗龋齿功能的膳食组合物，其特征在于，所述组合物包含在口腔中具有pH缓冲作用的缓冲剂、磷-钙补偿剂、磷制剂、和/或钙制剂。
9.如权利要求8所述的膳食组合物，其特征在于，所述缓冲剂是磷酸化寡糖或其糖醇。
10.如权利要求8所述的膳食组合物，其特征在于，所述缓冲剂选自磷酸化寡糖或其糖醇，其中磷酸化寡糖是由具有α-1，4键的3-5个葡萄糖组成的葡聚糖，其中一个磷酸基团与葡聚糖连接，或是由具有α-1，4键的2-8个葡萄糖组成的葡聚糖，其中两个磷酸基团与葡聚糖连接；硫酸软骨素；硫酸软骨素寡糖；葡萄糖-6-磷酸；寡半乳糖醛酸；和酒石酸。
11.如权利要求8所述的膳食组合物，其特征在于，所述缓冲剂是磷酸化寡糖或其糖醇，其中磷酸化寡糖是由具有α-1，4键的3-5个葡萄糖组成的葡聚糖，其中一个磷酸基团与葡聚糖连接，或是由具有α-1，4键的2-8个葡萄糖组成的葡聚糖，其中两个磷酸基团与葡聚糖连接。
12.如权利要求8所述的膳食组合物，其特征在于，所述缓冲剂是呈碱金属盐、碱土金属盐、或铁盐的形式。
13.如权利要求12所述的膳食组合物，其特征在于，所述缓冲剂是呈钠盐或钙盐的形式。
14.如权利要求8所述的膳食组合物，其特征在于，所述组合物进一步包含有效量的氟或用于抗龋齿的含氟物质。
15.一种具有抗龋齿功能的口腔组合物，其特征在于，所述组合物包括在口腔中具有pH缓冲作用的缓冲剂。
16.如权利要求15所述的口腔组合物，其特征在于，所述缓冲剂是磷酸化寡糖或其糖醇。
17.如权利要求15所述的口腔组合物，其特征在于，所述缓冲剂选自磷酸化寡糖或其糖醇，其中磷酸化寡糖是由具有α-1，4键的3-5个葡萄糖组成的葡聚糖，其中一个磷酸基团与葡聚糖连接，或是由具有α-1，4键的2-8个葡萄糖组成的葡聚糖，其中两个磷酸基团与葡聚糖连接；硫酸软骨素；硫酸软骨素寡糖；葡萄糖-6-磷酸；寡半乳糖醛酸；和酒石酸。
18.如权利要求15所述的口腔组合物，其特征在于，所述缓冲剂是磷酸化寡糖或其糖醇，其中磷酸化寡糖是由具有α-1，4键的3-5个葡萄糖组成的葡聚糖，其中一个磷酸基团与葡聚糖连接，或是由具有α-1，4键的2-8个葡萄糖组成的葡聚糖，其中两个磷酸基团与葡聚糖连接。
19.如权利要求15所述的口腔组合物，其特征在于，所述缓冲剂是呈碱金属盐、碱土金属盐、锌盐或铁盐的形式。
20.如权利要求19所述的口腔组合物，其特征在于，所述缓冲剂是呈钠盐、钙盐、或锌盐的形式。
21.如权利要求15所述的口腔组合物，其特征在于，所述组合物进一步包含有效量的氟或用于抗龋齿的含氟物质。
22.如一种具有抗龋齿功能的口腔组合物，其特征在于，所述组合物包含在口腔中具有pH缓冲作用的缓冲剂、磷-钙补偿剂、磷制剂、和/或钙制剂。
23.如权利要求22所述的口腔组合物，其特征在于，所述缓冲剂是磷酸化寡糖或其糖醇。
24.如权利要求22所述的口腔组合物，其特征在于，所述缓冲剂选自磷酸化寡糖或其糖醇，其中磷酸化寡糖是由具有α-1，4键的3-5个葡萄糖组成的葡聚糖，其中一个磷酸基团与葡聚糖连接，或是由具有α-1，4键的2-8个葡萄糖组成的葡聚糖，其中两个磷酸基团与葡聚糖连接；硫酸软骨素；硫酸软骨素寡糖；葡萄糖-6-磷酸；寡半乳糖醛酸；和酒石酸。
25.如权利要求22所述的口腔组合物，其特征在于，所述缓冲剂是磷酸化寡糖或其糖醇，其中磷酸化寡糖是由具有α-1，4键的3-5个葡萄糖组成的葡聚糖，其中一个磷酸基团与葡聚糖连接，或是由具有α-1，4键的2-8个葡萄糖组成的葡聚糖，其中两个磷酸基团与葡聚糖连接。
26.如权利要求22所述的口腔组合物，其特征在于，所述缓冲剂是呈碱金属盐、碱土金属盐、锌盐或铁盐的形式。
27.如权利要求26所述的口腔组合物，其特征在于，所述缓冲剂是呈钠盐、钙盐、或锌盐的形式。
28.如权利要求22所述的口腔组合物，其特征在于，所述组合物进一步包含有效量的氟或用于抗龋齿的含氟物质。
29.一种用于研究预期对牙齿具有抗龋齿作用的样品的补充矿质效果的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤在样品存在的情况下，使含有磷、钙、和牙齿成分的溶液进行钙沉淀反应；沉淀反应后，测定溶液中钙的浓度或沉淀的钙的量；在不含样品的情况下，使溶液进行钙沉淀反应；沉淀反应后，测定溶液中钙的浓度或沉淀的钙的量；和比较步骤(B)和(D)中溶液中钙的浓度或沉淀的钙的量。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述溶液含有羟磷灰石、缓冲液、KH2PO4和CaCl2。
全文摘要
本发明涉及具有抗龋齿功能的膳食组合物和口腔组合物。本发明提供具有抗龋齿功能的膳食组合物和口腔组合物，该组合物包含在口腔中具有pH缓冲作用的缓冲剂。
文档编号A61K8/60GK1501774SQ02805648
公开日2004年6月2日 申请日期2002年2月28日 优先权日2001年2月28日
发明者釜阪宽, 西村隆久, 户尾健二, 栗木隆, 冈田茂孝, 阪本礼一郎, 木村敏幸, 鱼津伸夫, 一郎, 久, 二, 夫, 孝, 幸 申请人:江崎格力高株式会社
技术领域：
本发明涉及具有抗龋齿功能的膳食组合物和口腔组合物。更具体地，本发明涉及具有抗龋齿功能的膳食组合物和口腔组合物，例如给牙齿补充矿质以减小龋齿的发生。
背景技术：
龋齿是一种由口腔中存在于牙齿表面的细菌引起的牙齿表面的脱矿质。具体地说，由于一些障碍使口腔细菌产生的有机酸不能扩散，牙齿暴露于高浓度的有机酸，因此牙齿表面被脱矿质。在此定义中，任何具有通过代谢发酵糖产生有机酸的能力的口腔细菌都能引起龋齿。适合有机酸生产的底物是糖类，包括单糖和寡糖(例如，葡萄糖和蔗糖)，和单糖的聚合物多糖(如淀粉)。
一般说来，有机酸不能分散归因于(1)从饮食中摄取的淀粉在牙颈和牙根上滞留，和(2)不溶解的葡聚糖粘附在牙齿上，这是使用易于降解的糖，例如蔗糖(即发酵的糖)作为底物由细菌产生的。
对于因素(1)，认为任何具有发酵糖能力的口腔细菌，例如乳酸杆菌是造成龋齿的原因。在这种情况下，已知龋齿的进展通常是缓慢的。产生高浓度有机酸的环境的发展取决于被动因素。
在含蔗糖的食物可广泛得到的今天，因素(2)是龋齿的主要原因。在这种情况下，认为变异链球菌(Streptococcus mutans)和表兄链球菌(s.sobrinus)是引起龋齿的原因。这两种细菌都是以链型发生的链球菌的一个类型，每个细胞具有约0.6μm直径的圆形。在蔗糖存在下，这两种细菌活跃地产生不溶于水的α-葡聚糖。该葡聚糖具有很好粘附于牙齿表面的特性。细菌迅速代谢蔗糖，发挥产生酸的能力。该细菌本身具有强的抗酸性并可在其它细菌不能生长的酸性环境中存活。不溶于水的葡聚糖的粘附性使细菌牢固地粘附于牙齿表面等地方。不溶于水的葡聚糖吸附于牙齿表面，使由细菌产生的有机酸不能扩散，导致牙齿表面暴露于高浓度有机酸的环境中。认为与因素(1)相比，产生高浓度有机酸的环境的形成取决于细菌的活性因素。在这种情况下，龋齿的发展比因素(1)引起的较快。
有一个新的方法通过在微观水平上考虑牙齿的健康来预防龋齿，即牙质的脱矿质和补充矿质(Yoichi Iijima，Takashi Kumagaya；Kariesu Kontororu Dakkai-toSaisekkaike-no-Mekanizumu[龋齿控制-脱矿质和补充矿质的机制(Caries Control-Mechanism of Demineralization and Remineralization)]，Ishiyaku Shuppan K.K.；21-51，1999)。牙齿表面是由钙和磷酸盐晶体羟磷灰石[Ca10(PO4)6(OH)2]制成的，并称为釉质。釉质是牙齿最坚硬的部分，并防止由于齿斑中的细菌产生的有机酸、食物中所含的酸等造成的釉质下的重要的钙或磷酸盐溶解(脱矿质)。
有机酸通过充满水的釉柱之间的间隙渗透釉质，并通过称为脱矿质的过程溶解羟磷灰石。钙和磷酸盐从釉质组织中损失导致釉质表层下最初的龋齿的发生。如下文所描述的，根据本发明，上述阶段的龋齿可以修复。钙和磷酸盐离子透过釉质表面下的龋齿部分及磷灰石的损失可通过称为补充矿质的过程恢复。
每当摄入含有发酵的碳水化合物的食物，齿斑的pH变为酸性并超过临界pH，脱矿质开始。这是由于齿斑中产生酸的细菌的作用。当齿斑被唾液缓冲时，齿斑的pH恢复中性，唾液中的钙和磷酸盐离子再通过齿斑进入牙质(这一过程被称为补充矿质)。
因此，预防和治疗龋齿的方法不应是引起龋齿使细菌产生有机酸的口腔细菌的营养物；不应是引起龋齿使细菌产生不溶于水的葡聚糖和有机酸的变异链球菌的营养物；应防止由于有机酸pH下降至脱矿质开始的pH以下(例如，应具有缓冲能力以防止pH下降)；应促进补充矿质等等。
迄今为止已知各种抗龋齿的药剂。
当使用蔗糖作为营养物和糖基转移酶作为酶变异链球菌产生不溶于水的葡聚糖时龋齿开始。此葡聚糖覆盖在牙齿表面，产生齿斑。当变异链球菌在齿斑内进行酸发酵时，牙齿被溶解掉并形成牙脱落。
关于抗龋齿的糖类，已提出一些不是变异链球菌的营养物的寡糖(S.Hamada等，J.Jpn.Soc.Starch Sci.，31卷，83-91页，1984)。这些抗龋齿的糖类的一个例子是palatinit(日本公开出版物2000-281550号)。当palatinit与氟或锌结合，促进牙齿的补充矿质。(日本公开出版物2000-247852号)。但是，palatinit的甜味差且不适合于食物。而且，对于palatinit补充矿质的效果需要高达约1-20wt％的浓度。
还已知糖醇(具体是木糖醇)是一种抗龋齿的药剂(例如，日本公开出版物2000-128752号和日本公开出版物2000-53549号)。日本公开出版物11-12143号公开了一种包含选自木糖醇、甘露醇、半乳糖醇和肌醇的一种或多种糖醇的口腔组合物。日本公开出版物11-12143号描述这些糖醇可促进牙齿补充矿质，但不抑制细菌的生长。虽然糖醇只在高浓度时有效，已知大量摄取糖醇引起稀粪。如下文实施例中所描述的，实质上没有证实木糖醇的效果。
另外，已报道和利用茶叶的一种成分多酚作为抗龋齿的药剂(S.Sakanaka等，Fragrance Journal，11卷，42-49页，1990)。但是，多酚的使用也引起味觉的问题并因此受到限制。
目前，据说氟对于补充矿质的作用是最有效的。氟可在约2ppm时发挥足够的效力。关于氟的效力，已澄清了以下两点(1)促进补充矿质；和(2)氟掺入羟磷灰石晶体，接着羟磷灰石晶体转化成抗脱矿质的坚硬的晶体结构(使用氟是期望效果(2)而不是(1))。最近，具有这种特性的氟已加入各种口腔组合物中。例如，日本公开出版物11-130643号公开了一种含有碳酸钙和可溶性氟化物的口腔组合物。已知氟化物离子和糖醇的结合增强氟补充牙齿矿质的能力(例如，日本公开出版物11-21217号，日本公开出版物2000-72638号，和日本公开出版物2000-154127号)。日本公开出版物8-12541号公开了一种含有变异酶(mutanase)和氟化物的组合物，它增强牙质并促进补充矿质而有效地防止龋齿。
本领域已知磷酸钙的供给促进牙齿补充矿质(例如，日本公开出版物11-228369号和日本公开出版物10-310513号)。
日本公开出版物11-29454号公开了一种含有碳酸钙和藻酸盐的口腔组合物。该组合物增强碳酸钙附着和保留在牙齿上的能力，因此获得令人满意的pH的中和及促进矿质的补充，产生极好的预防龋齿的效果。
日本公开出版物8-104696号描述了其中公开的磷酸化寡糖抑制钙和磷的沉淀和结晶(即钙化作用)，磷酸化寡糖不是引起龋齿的变异链球菌的营养物，因此不产生不溶于水的葡聚糖，并且磷酸化寡糖具有缓冲能力并具有防止pH下降的作用。上文描述的特性防止龋齿和齿斑的发生以及由变异链球菌引起的酸发酵。它还公开了包含于一种膳食组合物或口腔组合物中的磷酸化寡糖具有防止由于乳酸造成的pH下降的作用，乳酸是齿斑内发酵的产物，而对香味没有影响。然而，日本公开出版物8-104696号没有提示上述磷酸化寡糖能够如本文所描述的在低浓度时具有补充矿质的作用。
本
发明内容
因此，本发明涉及具有抗龋齿功能的物质。具体地说，本发明的目的是提供膳食组合物和口腔组合物，这些组合物通过牙齿补充矿质等减少龋齿的发生。
发明者通过使用各种物质精密地研究了预防龋齿的技术。结果，发明者发现了一种对牙齿具有补充矿质作用的缓冲剂，并完成了本发明。
根据本发明的一个方面，一种膳食组合物具有抗龋齿功能。该组合物包含一种在口腔内具有pH缓冲作用的缓冲剂。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂是磷酸化寡糖或其糖醇。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂选自磷酸化寡糖或其糖醇，其中中磷酸化寡糖是由具有α-1，4键的3-5个葡萄糖组成的葡聚糖，其中一个磷酸基团与葡聚糖连接，或者由具有α-1，4键的2-8个葡萄糖组成的葡聚糖，其中两个磷酸基团与葡聚糖连接；硫酸软骨素；硫酸软骨素寡糖；葡萄糖-6-磷酸；寡半乳糖醛酸；和酒石酸。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂是磷酸化寡糖或其糖醇。该磷酸化寡糖是由具有α-1，4键的3-5个葡萄糖组成的葡聚糖，其中一个磷酸基团与葡聚糖连接，或者是由具有α-1，4键的2-8个葡萄糖组成的葡聚糖，其中两个磷酸基团与葡聚糖连接。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂是以碱性金属盐、碱土金属盐和铁盐的形式存在。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂是以钠盐或钙盐的形式存在。
在本发明的一个实施例中，该膳食组合物进一步包含有效量的氟或含有抗龋齿的物质的氟。
根据本发明的另一个方面，一种膳食组合物具有抗龋齿的功能。该组合物包括一种在口腔中具有pH缓冲作用的缓冲剂，一种磷-钙补偿剂，一种磷制剂，和/或一种钙制剂。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂是磷酸化寡糖或其糖醇。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂选自磷酸化寡糖或其糖醇，其中磷酸化寡糖是由具有α-1，4键的3-5个葡萄糖组成的葡聚糖，其中一个磷酸基团与葡聚糖连接，或者由具有α-1，4键的2-8个葡萄糖组成的葡聚糖，其中两个磷酸基团与葡聚糖连接；硫酸软骨素；硫酸软骨素寡糖；葡萄糖-6-磷酸；寡半乳糖醛酸；和酒石酸。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂是磷酸化寡糖或其糖醇。该磷酸化寡糖是由具有α-1，4键的3-5个葡萄糖组成的葡聚糖，其中一个磷酸基团与葡聚糖连接，或者是由具有α-1，4键的2-8个葡萄糖组成的葡聚糖，其中两个磷酸基团与葡聚糖连接。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂是以碱性金属盐、碱土金属盐和铁盐的形式存在。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂是以钠盐或钙盐的形式存在。
在本发明的一个实施例中，该膳食组合物进一步包含有效量的氟或含有抗龋齿的物质的氟。
根据本发明的另一个方面，一种口腔组合物具有抗龋齿的功能。该组合物包含在口腔中具有pH缓冲作用的缓冲剂。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂是磷酸化寡糖或其糖醇。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂选自磷酸化寡糖或其糖醇，其中磷酸化寡糖是由具有α-1，4键的3-5个葡萄糖组成的葡聚糖，其中一个磷酸基团与葡聚糖连接，或者由具有α-1，4键的2-8个葡萄糖组成的葡聚糖，其中两个磷酸基团与葡聚糖连接；硫酸软骨素；硫酸软骨素寡糖；葡萄糖-6-磷酸；寡半乳糖醛酸；和酒石酸。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂是磷酸化寡糖或其糖醇。该磷酸化寡糖是由具有α-1，4键的3-5个葡萄糖组成的葡聚糖，其中一个磷酸基团与葡聚糖连接，或者是由具有α-1，4键的2-8个葡萄糖组成的葡聚糖，其中两个磷酸基团与葡聚糖连接。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂是以碱性金属盐、碱土金属盐，锌盐和铁盐的形式存在。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂是以钠盐、钙盐或锌盐的形式存在。
在本发明的一个实施例中，该口腔组合物进一步包含有效量的氟或含有抗龋齿的物质的氟。
根据本发明的另一个方面，一种口腔组合物具有抗龋齿的功能。该组合物包含一种在口腔中具有pH缓冲作用的缓冲剂，一种磷-钙补偿剂，一种磷制剂，和/或一种钙制剂。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂是磷酸化寡糖或其糖醇。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂选自磷酸化寡糖或其糖醇，其中磷酸化寡糖是由具有α-1，4键的3-5个葡萄糖组成的葡聚糖，其中一个磷酸基团与葡聚糖连接，或者由具有α-1，4键的2-8个葡萄糖组成的葡聚糖，其中两个磷酸基团与葡聚糖连接；硫酸软骨素；硫酸软骨素寡糖；葡萄糖-6-磷酸；寡半乳糖醛酸；和酒石酸。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂是磷酸化寡糖或其糖醇。该磷酸化寡糖是由具有α-1，4键的3-5个葡萄糖组成的葡聚糖，其中一个磷酸基团与葡聚糖连接，或者是由具有α-1，4键的2-8个葡萄糖组成的葡聚糖，其中两个磷酸基团与葡聚糖连接。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂是以碱性金属盐、碱土金属盐，锌盐或铁盐的形式存在。
在本发明的一个实施例中，该缓冲剂是以钠盐、钙盐或锌盐的形式存在。
在本发明的一个实施例中，该口腔组合物进一步包含有效量的氟或含有抗龋齿的物质的氟。
根据本发明的另一个方面，一种用于研究预期对牙齿具有抗龋齿作用的样品的补充矿质效果的方法，该方法包括步骤(A)在有样品的情况下，使含有磷、钙和牙齿成分的溶液进行钙沉淀反应；(B)沉淀反应后，测定溶液中钙的浓度或沉淀的钙的数量；(C)使不含有样品的溶液进行钙沉淀反应；(D)沉淀反应后，测定溶液中钙的浓度或沉淀的钙的数量；和(E)比较在步骤(B)和(D)中溶液中钙的浓度或沉淀的钙的数量。
在本发明的一个实施例中，该溶液含有羟磷灰石、缓冲液、KH2PO4和CaCl2。
附图简述
图1是显示使用牛的牙齿切片在补充矿质的试验系统中由于龋齿导致矿物质流失值的图。
图2是显示使用牛的牙切片在补充矿质的试验系统中损伤深度的图。
图3是显示在实施例4中一个简单的试验系统中使用磷酸化寡糖钠盐补充矿质的结果的图。
图4是显示在实施例4中一个简单的试验系统中使用磷酸化寡糖钙盐补充矿质的结果的图。
图5是显示当P/Ca为0.6时，磷酸化寡糖对补充矿质的影响的图。
图6A是显示在没有磷酸化寡糖的情况下，P/Ca浓度比的变化对补充矿质的影响的图。图6B是显示在有磷酸化寡糖钠盐的情况下，P/Ca浓度比的变化对补充矿质的影响的图。图6C是显示在有磷酸化寡糖钙盐的情况下，P/Ca浓度比的变化对补充矿质的影响的图。
图7A是显示在实施例5中磷酸化寡糖钙盐和磷酸化寡糖钠盐补充矿质的作用的图。图7B是显示木糖醇和木糖补充矿质作用的图。图7C是显示palatinit和异蔗糖(palatinose)的补充矿质作用的图。
图8是显示实施例7中TLC分析结果的照片。
图9是显示实施例7中磷酸化寡糖和氟对补充矿质的协同作用的图。
图10是显示实施例8中具有标准溶液浓度的磷酸化寡糖的TLC分析结果的照片。
图11是显示TLC分析结果的照片，该结果说明在实施例8中当食用含有口香糖的磷酸化寡糖时，随时间洗提的量。
图12是显示实施例12中各种物质的补充矿质的效果的图。
图13是显示实施例13中各种物质的补充矿质的效果的图。
图14是显示实施例14中一个人工口服装置中的pH变化的图。
图15是显示实施例16中当咀嚼含有POs Ca的口香糖或不含POs Ca的口香糖时唾液的量的图。
图16是显示实施例16中当咀嚼含有POs Ca的口香糖或不含POs Ca的口香糖时唾液的pH的图。
图17是显示实施例16中当咀嚼含有POs Ca的口香糖或不含POs Ca的口香糖时唾液的P含量的图。
图18是显示实施例16中当咀嚼含有POs Ca的口香糖或不含POs Ca的口香糖时唾液的Ca含量的图。
图19是显示实施例16中当咀嚼含有POs Ca的口香糖或不含POs Ca的口香糖时Ca/P比的变化的图。
图20A是显示实施例16中在每一个处理的牙齿中损伤深度的图。图20B是显示实施例16中在每一个处理的牙齿中矿物质流失值的图。
图21是显示实施例17中补充矿质比率的图。
图22是显示实施例18中当食用含有POs Ca的糖果时分泌的唾液的pH的图。
图23是显示实施例18中当食用含有POs Ca的冰糖时分泌的唾液的量的图。
图24是显示实施例18中当食用含有POs Ca的糖果时分泌的唾液的Ca和P含量的图。
图25是显示利用含有POs Ca的糖果和含有POs Ca的软糖补充矿质的试验结果的图。
图26是显示有代表性的磷酸化寡糖的化学结构式的图。
实施本发明的最佳模式下文中将更详细地描述本发明。
本文使用的术语“抗龋齿功能”是指预防龋齿和治疗龋齿的功能。治疗龋齿的功能是指修复曾经由于龋齿而损失的牙齿的部分的功能。本文使用的术语“抗龋齿功能”是指一个或多个如下特性(1)防止由于口腔细菌产生的酸造成的pH下降的pH缓冲能力；(2)防止口腔细菌产生不可溶的葡聚糖的能力；和(3)在龋齿的早期促进牙齿补充矿质的能力。较佳地，该抗龋齿功能具有两个上述特性，最佳地具有全部的上述特性。
本发明的组合物可稳定地对腐蚀的牙齿提供磷酸盐和钙。提供了磷酸盐和钙的牙齿被补充矿质，因此由于龋齿损失的牙齿部分可被修复。
根据本发明，一种缓冲剂加入到口腔中，因此在牙齿补充矿质中稳定地使用存在于口腔的唾液等中的磷酸盐和钙。因此，可以实现常规认为很难或不可能的牙齿的修复。
如果在适当的条件下，将钙或磷酸盐提供给脱矿质的釉质部分(补充矿质)，可修复脱矿质损伤达到完好状态。为了保持牙齿的完好状态，需要通过唾液提供矿物质给脱矿质的损伤，以便在微观水平上平衡脱矿质和补充矿质。通常，在吃或喝东西后齿斑中的pH往往降低，脱矿质和补充矿质之间的平衡被改变。当脱矿质＞补充矿质时，损伤发生。相反，当补充矿质＞脱矿质时，由于牙齿的补充矿质，脱矿质的损伤被修复。脱矿质和补充矿质之间的平衡很大程度上取决于口腔环境(具体地说，唾液和齿斑中的pH，钙和磷酸盐的浓度)。本发明提供一种补充矿质似乎可以发生的口腔环境，从而预防龋齿和治疗脱矿质损伤(龋齿的早期阶段)以获得健康而坚固的牙齿。
本文使用的术语“缓冲剂”是指在口腔中显示pH缓冲作用的试剂。具体地说，该缓冲剂是一种从例如缓冲剂的阴离子和阳离子获得的水溶性盐。口腔中缓冲剂的存在可稳定口腔中的pH。该缓冲剂稳定唾液中的磷酸盐离子和钙离子。因此，具体地说，优选一种在有磷酸盐离子和钙离子的情况下具有良好的pH缓冲作用的试剂。更优选地，当缓冲剂添加到含有磷酸盐离子和钙离子的水溶液中，磷酸盐离子和钙离子的稳定性不被缓冲剂所抑制。换句话说，似乎可与磷酸盐离子和钙离子起反应并形成沉淀的缓冲剂是不可取的。
此外，在本发明中，较佳地在齿斑中获得pH缓冲效果。如果在唾液中显示pH缓冲作用，那么pH的缓冲作用典型地显示于齿斑中。因此，在唾液中显示pH缓冲作用的缓冲剂可用于显示齿斑中的pH缓冲作用。一个氢离子敏感场效应晶体管电极(PH-6010由Nihon Kohden公司生产)可放置在一个釉质切片上并掺入下颌的部分托牙的牙齿间隙部分。此后，在电极敏感部分上形成的齿斑中的pH可根据YoshizumiTamasawa等(日本牙齿修复协会学报Journal of the Japan Prosthodontic Society，40卷特刊，147页，1996)，Kazuhiko Abe(DENTAL OUTLOOK，90(3)，650-654，1997)，Takahashi-Abbe，S等(Oral Microbiol.Immunol.，16，94-99页，2001)中描述的方法测定。齿斑中的pH较佳是6或更多，更佳是7或更多。当由于缓冲作用引起齿斑中的pH恢复到中性时，存在于口腔唾液中的磷酸盐离子和钙离子供应给牙齿表面，导致牙质补充矿质。齿斑中pH的上限没有具体限制，但是对于一个实际的生物体不想要一个高的碱性条件。齿斑中的pH较佳是10或更少，更佳是8或更少。
缓冲剂典型地以盐的形式使用，可任选地以游离酸的形式使用。即使缓冲剂在口腔中以游离酸的形式给予，由于可与游离酸一起形成盐的碱性金属等存在于口腔中，基本上可以说游离酸的盐提供给口腔。
可用于本发明的较佳的缓冲剂可通过简单的试验容易地选择。具体地说，各种已知的pH缓冲剂加入含有磷酸盐离子和钙离子的中性水溶液中(例如pH 6-8的水溶液)。观察沉淀的出现或不出现。在这种试验中没有形成沉淀的pH缓冲剂可满意地用作加入到本发明抗龋齿组合物中的缓冲剂。
当缓冲剂不存在时，由于口腔细菌产生的有机酸的作用口腔可被酸性化(即唾液或齿斑变为酸性)。当唾液或齿斑被酸性化时，牙齿的钙和磷作为Ca和P离子被洗脱，引起龋齿的发生。在这种情况下，如果缓冲剂存在，口腔中唾液和齿斑的pH稳定在中性pH左右，由此龋齿的形成似乎不会发生。
通常唾液的pH在中性左右。因此，在中性左右的pH具有良好的缓冲作用的缓冲剂是优选的。
较佳地，该缓冲剂是一种不与唾液中的磷酸盐反应而形成沉淀的试剂。
较佳地，该缓冲剂是一种不与唾液中的钙反应而形成沉淀的试剂。
较佳地，该缓冲剂是一种酸性官能团。
较佳地，该缓冲剂具有任何一种磷酸基、羧基、和硫酸基。
较佳地，该缓冲剂在其分子中具有三个或更少的酸性官能团，更佳地两个或更少的酸性官能团。当分子中存在过量的酸性官能团时，其向羟磷灰石供给磷和钙的能力似乎减少。例如，在它们的分子中具有一个或两个磷酸基的磷酸化寡糖具有改良的龋齿治疗的功能，超过在其分子中具有6个磷酸基的植酸的功能。因此，优选使用缓冲剂而不是例如植酸的一种物质。
具有极好的向羟磷灰石提供磷和钙的能力的缓冲剂是优选的。缓冲剂向羟磷灰石提供提供磷和钙的能力可通过如下述的简单的补充矿质的试验系统方法方便地测定。
缓冲剂的例子包括磷酸化寡糖及其糖醇。本文使用的术语“磷酸化寡糖”是指在其分子中具有至少一个磷酸基团的寡糖，较佳地三个或更少的磷酸基团，更佳地两个或更少的磷酸基团。本文使用的术语“中性寡糖”是指没有磷酸基团与其连接的寡糖。例如，该磷酸化寡糖可以是由α-1，4键连接的3-5个葡萄糖组成的葡聚糖，其中一个磷酸基团与葡聚糖连接。另外，磷酸化寡糖可以是由具有α-1，4键的2-8个葡萄糖组成的葡聚糖，其中两个磷酸基团与葡聚糖连接。缓冲剂的例子包括，但不限于酸性糖类及其糖醇(例如，寡半乳糖醛酸、硫酸软骨素、硫酸软骨素寡糖、葡萄糖-6-磷酸)，有机酸(例如酒石酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、延胡索酸、和马来酸)、核酸(例如各种核苷或核苷酸的磷酸酯)、氨基酸，和上述磷酸化寡糖的糖醇。
上述缓冲剂可以是盐的形式，例如金属盐，以使缓冲剂有效。用于形成这种金属盐的金属的例子包括碱性金属、碱土金属、锌、铁、铬和铅。例如，包括钾、钠、钙和镁。作为包含于本发明的膳食组合物的缓冲剂的金属盐，钙盐和钠盐是优选的。作为包含于本发明的口腔组合物的缓冲剂的金属盐，钙盐、钠盐和锌盐是优选的。虽然，锌盐不用于食物和饮料，但已知锌盐具有预防口臭和治疗牙周病的作用。因此，作为口腔组合物包含的金属盐锌盐是优选的。此外，缓冲剂可以是铵盐或季铵盐的形式。
硫酸软骨素典一般每两个糖之间含有一个硫酸基团。硫酸基团连接于硫酸软骨素A中N-乙酰-D-半乳糖胺的4-位，和硫酸软骨素C中N-乙酰-D-半乳糖胺的6-位。硫酸软骨素B(普遍地称为硫酸皮肤素)具有N-乙酰-D-半乳糖胺-4-硫酸和L-艾杜糖醛酸的双糖单元的重复结构。硫酸软骨素可被软骨素酶降解成为在非还原末端具有未饱和的己糖醛酸的寡糖的双糖。例如，硫酸软骨素可通过软骨素酶ABC(衍生自普通变形菌)、软骨素酶ACI(衍生自肝素黄杆菌)、或软骨素酶ACII(衍生自金黄节杆菌)(后两种酶不对硫酸皮肤素起作用)降解成为在它们的还原末端具有己糖胺的不饱和双糖。硫酸软骨素，和通过用这种酶降解硫酸软骨素获得的不饱和寡糖(较佳地双糖和四糖)具有补充矿质的作用。
寡半乳糖醛酸是一种聚合的半乳糖醛酸的寡糖，该寡糖已知为果胶的组成糖。寡半乳糖醛酸较佳地包含2个或更多的糖，更佳地3个或更多，甚至更佳地4个或更多，并且较佳地10个或更少，更佳地8个或更少，甚至更佳地6个或更少。
本文使用的术语“糖醇”是指其还原末端被还原的糖。例如，磷酸化寡糖的糖醇可通过向磷酸化寡糖的还原末端加入氢产生。氢的加入可使用本领域熟练的技术人员已知的任何方法进行。例如，可通过制备pH 8的1N氢氧化钠水溶液的弱碱溶液，向100ml的该弱碱溶液中加入30ml的3％氢氧化硼钠溶液，并使该混合物在40℃放置1小时还原寡糖。可通过使用本领域熟练的技术人员已知的镍催化剂的典型方法工业生产糖醇。
由于缓冲剂包含于本发明的膳食组合物和口腔组合物中，优选的磷酸化寡糖是由通过α-1，4键偶联的3-5个葡萄糖组成的葡聚糖，其中一个磷酸基团与葡聚糖连接，或磷酸化寡糖是由通过α-1，4键偶联的2-8个葡萄糖组成的葡聚糖，其中两个磷酸基团与葡聚糖连接。
这种磷酸化寡糖可从通常的天然植物淀粉制备，较佳地从具有许多磷酸基团的淀粉中制备。用于生产磷酸化寡糖的淀粉的起始植物的例子包括土豆、甘薯、木薯、玉米、小麦、水稻、糯米、糯玉米、糯小麦、糯土豆、野葛、山药、百合、和栗子。在这些物质中，地下茎、水稻、小麦等含有许多连接的磷酸基团，且是适合用于制备磷酸化寡糖的材料。例如，在马铃薯淀粉中，磷酸基团相对通常地通过酯键与葡萄糖的3-位或6-位结合作为淀粉的一个组分。磷酸基团主要存在于支链淀粉中。当淀粉用于生产磷酸化寡糖时，也可优选使用化学修饰的淀粉。化学修饰的淀粉通过连接磷与如上所述的天然淀粉获得。例如，取自玉米、糯玉米等的淀粉与磷化学偶联以制备磷酸化寡糖。
上述包含于本发明的膳食组合物和口腔组合物中的磷酸化寡糖可如下生产。
为了酶解淀粉等，使至少一种选自淀粉分解酶例如α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)、葡糖淀粉酶(CE 3.2.1.3)、异淀粉酶(EC 3.2.1.68)、支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)、和新支链淀粉酶(Kuriki等，Journal of Bacteriology，170卷，1554-1559页，1988)；和糖基转移酶例如环糊精葡聚糖转移酶(EC 2.4.1.19；下文中称为CGTase)对淀粉起作用。另外，至少一种上述的酶与α-葡糖苷酶结合使用。
不具有支链结构的磷酸化糖类可通过用异淀粉酶和支链淀粉酶切割淀粉中的α-1，6支链结构降解淀粉获得。如果不使用异淀粉酶和支链淀粉酶，可获得具有α-1，6支链结构的磷酸化糖类。通过用葡糖淀粉酶降解磷酸化糖类，与磷酸化糖类的非还原末端连接的非磷酸化葡萄糖可成功地释放。用这种酶处理，每单位分子量的纯化磷酸化糖类的磷酸基团的数量可增加或减少。
由大多数种类的酶的降解可通过使酶与淀粉反应同时进行。简言之，淀粉作为原料溶解于水或具有调节的pH的缓冲液中使酶可作用于淀粉。液化的α-淀粉酶、支链淀粉酶、葡糖淀粉酶等同时加入反应溶液中，并使得到的溶液在加热时反应。用这种方法，当淀粉被凝胶化时，可释放中性的糖类，可释放与磷酸化糖类的非还原末端结合的非磷酸化葡萄糖，或可切割从磷酸化糖类结构材料中的衍生的α-1，6支链结构。这种方法使通过一步反应获得具有增加的磷酸含量的磷酸化糖类成为可能，而不是两步反应。
在通过使大多数种类的酶在各个步骤中分别作用于淀粉进行包括两步或更多步骤的酶反应的情况下，应用酶的次序不限于具体的顺序。然而，如果淀粉的浓度高，较佳地淀粉首先用包括液化的淀粉酶的酶处理。如果使异淀粉酶或支链淀粉酶作用于淀粉，直链淀粉含量增加。直链淀粉与支链淀粉相比可能老化和沉淀，因此淀粉老化并沉淀。从而，其它的酶不再作用于淀粉。
对于所使用的淀粉降解酶、糖基转移酶、α-葡糖苷酶的起源没有具体的限制。例如，α-淀粉酶较佳地是衍生自芽孢杆菌属的细菌或曲霉属的淀粉降解酶制剂。酶的反应条件是酶可行使功能的任何温度和pH。例如，优选使用的温度在25℃到70℃的范围内，pH在4到8的范围内。
首先，作为原料的淀粉溶解于水或具有调节的pH的缓冲溶液中，这样酶可作用于淀粉。液化的α-淀粉酶加入获得的溶液中，并使之在加热时反应，借此当被凝胶化时淀粉液化。此后，液化的淀粉在20-80℃的温度保持适当的一段时间。只要它可以液化淀粉可使用任何量的液化的α-淀粉酶。较佳的液化α-淀粉酶的量为20-50,000U。只要淀粉液化到在随后的步骤过程中淀粉不老化的程度，该保持时间没有限制。较佳地，在20-80℃保持时间为30分钟。
在液化完成后，不特别需要酶的灭活，但酶可通过通常使用的方法灭活，即在100℃保持10分钟。此外，可用通常使用的方法例如离心或膜过滤分离和除去不溶解的物质。此后，磷酸化的糖类可被分馏。当需要具有增加的磷酸含量的磷酸化糖类时，进行下述的另外的步骤。
简言之，原料被液化后，葡糖淀粉酶、异淀粉酶、支链淀粉酶、和α-葡糖苷酶同时或以适当的次序加入液化的原料以使原料糖化。例如使糖化的原料在40-60℃的温度反应30分钟到40小时，借此中性的糖和与磷酸化糖类的非还原末端连接的非磷酸化葡萄糖可从原料中释放，并且衍生自原料的磷酸化糖类结构中的α-1，6支链结构可被切割。当葡糖淀粉酶、异淀粉酶、和支链淀粉酶结合使用时，该结合及添加的次序没有限制。添加的酶的量以及保持的时间可取决于所需的磷酸化糖类的磷酸含量而确定。较佳地，可加入葡糖淀粉酶500-700U，异淀粉酶2-100U，支链淀粉酶2-100U，和α-葡糖苷酶50-700U。较佳地可使用固定化酶。
与各个酶的反应完成后，不特别需要酶的灭活，但可用通常使用的方法灭活酶，即在100℃保持10分钟。此外，用通常使用的方法例如离心或膜过滤分离和除去不溶的物质。
为了从含有磷酸化寡糖的糖类混合物中纯化磷酸化寡糖，因为不象中性糖类磷酸化糖类是离子物质，所以可使用阴离子交换树脂。对于树脂的类型没有具体的限制。树脂较佳的例子包括Chitopearl BCW 2500型(由Fuji Spinning Co.，Ltd.生产)，Anberlite IRA型(由Japan Organo Co.，Ltd生产)，DEAE-纤维素(由Whatman生产)，DEAE-Sephadex和QAE-Sephadex(由Pharmacia生产)，和QAE-CELLULOSE(由BioRad生产)。通过使用其pH适当调节的缓冲液平衡树脂。例如，优先使用约10-50mM乙酸盐缓冲液。平衡的树脂装入柱，并装入含有磷酸化寡糖的糖混合物。通过洗涤除去中性糖类，然后吸收到柱上的磷酸化寡糖用碱性溶液或盐溶液洗提。
在使用增加了离子强度的洗提液洗提磷酸化寡糖的情况下，对所使用的盐的种类没有具体限制。盐的较佳的例子包括氯化钠、碳酸氢铵、氯化钾、硫酸钠和硫酸铵。
在使用pH改变为碱性的洗提液洗提磷酸化寡糖的情况下，对于使用的碱性试剂的种类没有具体限制。例如，可使用铵、碳酸钠或氢氧化钠。然而，在强碱条件下，磷酸基团从糖中释放或糖的还原末端被氧化。因此，磷酸化寡糖较佳地在弱酸到弱碱的pH范围内洗提，更佳地pH范围为3-8。
在上述情况下，通过使用逐渐或以分步形式增加洗提液的盐浓度或pH洗提磷酸化糖，磷酸化糖可依赖于与一个磷酸化糖分子结合的磷酸基团的数量进行分馏。
活性炭也可用来代替阴离子交换树脂以从含有磷酸化寡糖的糖混合物中纯化磷酸化寡糖。对于使用的活性炭的种类没有具体限制，但较佳地使用能够装入柱的颗粒状活性炭。使用缓冲液、酸、碱、盐溶液和蒸馏水制备活性炭，这样获得吸附除葡萄糖外的中性糖类的能力。例如，较佳地可使用已装入柱并用蒸馏水洗涤的具有一致粒径的脱气的活性炭。通过将样品加到柱上并使中性糖类吸附到柱上，磷酸化寡糖可作为通过的部分获得。
另外，通过加入具有1-3个碳原子的醇沉淀磷酸化寡糖，以从含有磷酸化寡糖的糖混合物中纯化磷酸化寡糖。简言之，向样品溶液中加入醇仅仅使磷酸化寡糖沉淀。期望的是，如果样品溶液具有10％或更大的糖浓度，向一份体积的样品溶液中加入3份或更多体积的醇。
在金属盐、较佳地是钙盐或铁盐加上醇存在的条件下，磷酸化寡糖形成磷酸化糖金属盐并可能沉淀。由于这个原因，在有金属盐的情况下，使用即使少量的醇与仅使用醇的情况比较，磷酸化寡糖更易回收。较佳地，在碱性条件下磷酸化寡糖沉淀。对使用的盐的种类没有具体的限制。例如，较佳地可使用氯化钙、氯化镁、或氯化亚铁，因为它们具有良好的溶解性。通过加入醇产生的沉淀的收集来用通常使用的方法进行，例如倾析、过滤和离心。
磷酸化寡糖可通过从磷酸化寡糖金属盐中除去金属盐产生，该磷酸化寡糖金属盐通过加入金属盐沉淀。可通过通常使用的方法进行金属盐的去除(脱盐)。脱盐可使用例如台式脱盐microacilyzer G3(由Asahi Chemical Industry Co.Ltd生产)容易地进行。
得到的磷酸化糖溶液、磷酸化糖或磷酸化糖衍生物可使用通常所用的干燥方法，例如热空气干燥、流化床干燥和真空干燥等浓缩或研粉。如果需要，通过除去醇可获得可用于膳食或口服应用的磷酸化糖。
在马铃薯淀粉中，磷酸基团相对通常地以酯键与葡萄糖的3-位或6-位连接作为淀粉的一个组分。因此，使用各种淀粉酶从马铃薯淀粉中制得的磷酸化寡糖可能是其磷酸基团主要与葡萄糖的3-位或6-位结合的寡糖。例如，如果磷酸基团结合于通过使葡糖淀粉酶作用于马铃薯淀粉获得的磷酸化寡糖中的葡萄糖的6-位，该淀粉可在其6-位具有磷酸基团的葡萄糖前(在非还原末端一侧)立刻被切割。因此，磷酸化寡糖是具有葡萄糖的寡糖，该葡萄糖的6-位在非还原末端与磷酸基团结合或者该葡萄糖具有一种结构，该结构中从非还原末端开始至少第二个葡萄糖其6-位与磷酸基团结合。如果磷酸基团与磷酸化寡糖中葡萄糖的3-位结合，从非还原末端开始的第二个葡萄糖的3-位与磷酸基团结合。图26中显示了通过使用各种淀粉酶水解马铃薯淀粉获得的磷酸化寡糖的代表性的例子。当然，具有上述结构的磷酸化寡糖不限于经各种淀粉酶水解马铃薯淀粉生产的寡糖。具有相似结构的磷酸化寡糖具有相似的抗龋齿功能。
本文使用的术语“磷酸化寡糖的糖醇”是指通过还原磷酸化寡糖的还原末端获得的化合物。上述磷酸化寡糖的糖醇可通过向磷酸化寡糖的还原末端加入氢生产。可使用本领域熟练的技术人员已知的任何方法进行氢的加入。例如，可通过制备pH 8的1N氢氧化钠水溶液的弱碱溶液，加入30ml的3％氢氧化硼钠溶液，并使混合物在40℃放置1小时还原寡糖。可通过使用本领域熟练的技术人员已知的镍催化剂的典型的方法工业生产糖醇。
上述磷酸化寡糖或其糖醇可以是盐的形式，例如金属盐。用于形成这种金属盐的金属的例子包括碱性金属、碱土金属、锌、铁、铬和铅。例如，包括钾、钠、钙和镁。作为包含于本发明的膳食组合物中的磷酸化寡糖的金属盐，钙盐和钠盐是优选的。作为包含于本发明的口腔组合物中的磷酸化寡糖的金属盐，钙盐、钠盐和锌盐是优选的。虽然，锌盐不用于食物和饮料，但已知锌盐具有预防口臭和治疗牙周病的作用。因此，作为口腔组合物包含的金属盐锌盐是优选的。此外，磷酸化寡糖可以是铵盐或季铵盐的形式。
这种金属盐可如下进行生产。磷酸化寡糖和金属盐的化合物磷酸化寡糖盐可通过如上述的醇沉淀进行沉淀。如果需要，回收的沉淀可再溶解于水或适当的溶液中，随后加入醇。可重复这一操作。使用这一操作，可除去如中性糖和过量的盐等杂质。可使用超滤膜除去如盐等杂质。
已知上述磷酸化寡糖具有如下特性(1)不被龋齿致病菌所利用(即变异链球菌和表兄链球菌)；(2)抑制由于通过这些细菌以浓度依赖性的形式利用蔗糖产生的pH中的还原；和(3)这种抑制依赖于磷酸化寡糖的缓冲能力(见日本公开出版物8-104696号)。根据本发明，进一步发现盐形式的磷酸化寡糖及其糖醇具有在非常低的浓度促进牙齿补充矿质的作用。通过利用磷酸化寡糖的这种特性，可获得具有抗龋齿功能的膳食组合物和口腔组合物。具体地说，在低浓度充足地获得补充矿质作用的事实对于加入到食物中是非常有利的。
本发明的膳食组合物和口腔组合物含有一定量的缓冲剂，这样缓冲剂在口腔中有效地显示抗龋齿的功能。例如，就磷酸化寡糖钠盐来说，其量可以在口腔中盐的浓度是0.01-20％，较佳是0.03-1％。例如，就磷酸化寡糖钙盐来说，其量可以在口腔中盐的浓度是0.01-20％，较佳是0.03-1％。例如，就磷酸化寡糖锌盐来说，其量可以在口腔中盐的浓度是0.01-20％，较佳是0.03-1％。对于所有的磷酸化寡糖钠盐、磷酸化寡糖钙盐、和磷酸化寡糖锌盐，最佳地，它们在口腔中的浓度为约0.2％，其中口腔中无机钙和磷的浓度为约1.5mM和0.9mM。
通过考虑在口腔中本发明的膳食组合物和口腔组合物的保留时间确定这些添加剂的量。对于需要咀嚼行为的膳食组合物将给出一种意向。例如，就含有约20％磷酸化寡糖的口香糖来说，磷酸化寡糖从膳食组合物中洗提，并且咀嚼后相对高浓度(约1％到约5％)的磷酸化寡糖可存在约10分钟。约20分钟到30分钟后，只有0.25％或更少的磷酸化寡糖存在于口腔中。因此，口腔中磷酸化寡糖的浓度被稀释为食物中浓度的1/4或更少。因此，就这种食物来说，缓冲剂可以预期在口腔中的四倍或少一些的浓度加入食物中(例如，一到四倍)。另一方面，关于不需要咀嚼行为的组合物(例如饮料)，在口腔中的保留时间在1分钟以内。这种组合物在口腔中没有充分地稀释。因此，磷酸化寡糖以基本上等于口腔中期望浓度(例如，0.1％到5％)掺入组合物。本发明的膳食组合物和口腔组合物可含有单独的或结合的上述的缓冲剂，这样可在口腔中保留上述的剂量。
另一方面，本发明的膳食组合物和口腔组合物进一步含有任何一种磷-钙补偿剂、磷制剂和钙制剂、或另外除上述缓冲剂外一种或多种的组合。具体地说，当组合物包含钙盐时，过量的钙从钙盐中释放，以致组合物中钙磷比发生变化。而且，加入的缓冲剂可对从牙齿中洗提钙有影响。在这种情况下，如果通过缓冲剂改变的口腔唾液中磷钙浓度的比被补偿，牙齿补充矿质可更加有效。对于正常人，唾液中钙磷的摩尔比(下文中称为“Ca/P”)通常为0.25-0.67(P/Ca＝1.45-3.9)，因此，存在的磷比钙多(即，差不多3摩尔磷比2摩尔钙到3.9摩尔磷比1摩尔钙)。牙齿的组分羟磷灰石(表示为Ca10(PO4)6(OH)2))具有1.67的Ca/P比(P/Ca＝0.6)。组成牙齿釉质的成分具有1.0-1.67的Ca/P比(P/Ca＝0.6-1.0)。因此，通过和缓冲剂一起提供磷和/或钙使Ca/P接近1.0-1.67(P/Ca＝0.6-1.0)，较佳地1.67((P/Ca＝0.6)，它可能促进这些物质结晶进入羟磷灰石。
可补偿Ca/P的试剂这里称为“磷-钙补偿剂”。这种磷-钙补偿剂的例子包括一价的磷酸钙(Ca(H2PO4)2·H2O)、二价的磷酸钙(CaHPO4·2H2O)、三价的磷酸钙、焦磷酸钙、羟磷灰石粉、无定形磷酸钙、牛骨钙、蛋壳钙、珊瑚钙、珍珠钙、鱼和贝类的钙、以及三价的α-磷酸钙。本文中补偿Ca/P是指保持Ca/P基本上约在1.0-1.67(P/Ca＝0.6-1.0)的范围内。在这种情况下，Ca/P不需要严格地限制在1.0-1.67(P/Ca＝0.6-1.0)。只要Ca/P可基本上接近约1.0-1.67(P/Ca＝0.6-1.0)，Ca/P可下降至1.0-1.67(P/Ca＝0.6-1.0)的范围之外。补偿所需的补偿剂的量随缓冲剂和补偿剂的种类而变化，但是如果需要，这种量的范围可通过本领域熟练的技术人员进行简单的试验确定。就磷-钙补偿剂而言，对于加入的一份缓冲剂，其适当的摩尔量为1/20份至20份，较佳地1/2份到2份。
既然磷在唾液中是过量的，可使用Ca制剂调整Ca/P到1.0-1.67(P/Ca＝0.6-1.0)。在人的唾液中，磷浓度是3-3.5mM，而钙浓度是0.9-2mM。因此，较佳地加入约4-5mM的钙以提高钙浓度。因此，可使用钙盐(缓冲剂)作为磷-钙补偿剂。就含有3％钙的磷酸化寡糖而言，加入约0.7％磷酸化寡糖钙是适当的。钙制剂较佳的例子包括，但不限于碳酸钙、氯化钙、乳酸钙、葡萄糖酸钙、乳清钙、有机酸钙、胶体碳酸钙、酪蛋白磷肽钙和氟化钙。
本发明的膳食组合物和口腔组合物进一步含有磷制剂。本文使用的术语“磷制剂”是指磷酸盐化合物。磷酸盐化合物的例子包括磷酸钠、磷酸氢钠、磷酸钾、和磷酸氢钾。
上述磷-钙补偿剂、磷制剂、或钙制剂可单独或结合加入本发明的膳食组合物和口腔组合物以使Ca/P接近1.0-1.67(P/Ca＝0.6-1.0)，并较佳地为1.67(P/Ca＝0.6)。
本文使用的术语“膳食组合物”是人的食物、饲养动物或鱼的饲料、和宠物食物的总称。具体而言，本发明的膳食组合物包括液体和粉末饮料如咖啡、茶、绿茶、乌龙茶、果汁、加工牛奶、和运动饮料；焙烤食物例如面包、比萨饼和馅饼；焙烤甜食例如曲奇饼、脆饼、饼干和蛋糕；意大利面食如意大利式细面条和通心粉；面条例如小麦面条、荞麦面条、和中式面条；甜品例如糖果、软糖、口香糖、和巧克力；小吃例如爆米花和马铃薯片；冰冻甜食例如冰激凌和果汁牛奶冻；乳制品例如奶油、干酪、奶粉、炼乳和乳制饮料；西方不烘焙的糖果类点心例如果冻、布丁、奶油冻、和酸牛奶；日本甜食例如奶油小圆甜面包、uirou(通过向面粉中加入糖，随后蒸煮获得的切成方形年糕)、年糕、和ohagi(用豆酱等包裹的米团)；调味品例如酱油、蘸的调味汁、面条汤、辣酱油、原汁肉汤、炖家畜、汤、混合的调味品、咖哩粉、蛋黄酱、和番茄沙司；听装或杀菌袋装食物例如咖喱、炖肉、汤和米饭；冷冻和冷藏食品例如火腿、汉堡包、肉圆、炸丸子、中国式汤团、炒饭和米团；海加工产品例如tikuwa(管状鱼酱)和kamaboko(鱼酱饼)；和米制产品例如野外午餐的米饭和寿司。另外，由于本发明的膳食组合物具有使钙易于吸收的能力，因此它包括配制的婴儿喂养奶、断乳食品、婴儿食品、宠物食品、动物饲料、运动食品、营养滋补品和保健品。
在一个较佳的实施例中，食物和饮料是在食用时需要大量咀嚼的种类，例如口香糖。就被大量咀嚼的食物和饮料来说，缓冲剂容易地在口腔中扩散，产生抗龋齿的良好效果。就被大量咀嚼的食物和饮料来说，较佳地缓冲剂可以0.1-50％的重量比，更佳地0.5-20％的重量比，甚至更佳地0.5-10％的重量比，特别优选地0.5-5％的重量比加入食物中。具体地，例如，这种食物是含有0.1-50％的重量比的缓冲剂的口香糖，或含有0.1-50％的重量比的缓冲剂的片状糖食、糖果、软糖等。
在另一个较佳的实施例中，食物和饮料是在食用时不需要咀嚼的种类，例如饮料(如果汁或淡水)。就食用时不需要咀嚼的食物或饮料来说，较佳地缓冲剂可以0.1-70％的重量比，更佳地0.1-50％的重量比，甚至更佳地0.2-5％的重量比混合到食物中。具体地说，例如，该食物是含有重量比为1-30％的缓冲剂的果汁。较佳地，该食物是含有重量比为0.1-10％的缓冲剂的蔬菜汁、天然果汁、乳制饮料、牛奶、豆奶、运动饮料、近水饮料、营养饮料、咖啡饮品、或可可饮料。
在另一个较佳的实施例中，食物和饮料是在食用时与平常主食咀嚼一样多的种类。较佳地，该食物和饮料是主食和饮料。例如，这种食物是米饭。就主食来说，既然以足够的量食用食物，即使加入少量的缓冲剂有利地提供了预防龋齿的显著和长期的效果。就与平常主食物咀嚼一样多的食物来说，较佳地缓冲剂可以0.01-20％的重量比，更佳地0.02-10％的重量比，甚至更佳地0.03-5％的重量比，特别优选地0.05-3％的重量比加入食物中。具体地说，该食物是，例如含有重量比为0.02-10％的缓冲剂的米饭，含有重量比为0.01-20％磷酸化寡糖的面包等。
当然，本发明可用于除了上述较佳的实施例中所描述的那些以外的食物和饮料。具体而言，本发明可用于，例如，含有重量比为0.1-20％的缓冲剂的中国面条，含有重量比为0.1-20％的缓冲剂的小麦面条，含有重量比为0.1-20％的缓冲剂的年糕，含有重量比为0.1-20％的缓冲剂的椒盐卷饼，含有重量比为0.1-20％的缓冲剂的琼脂，含有重量比为0.1-20％的缓冲剂的果冻，含有重量比为0.1-20％的缓冲剂的酸牛奶，含有重量比为0.1-20％的缓冲剂的曲奇饼，含有重量比为0.1-20％的缓冲剂的片状甜食，含有重量比为0.1-20％的缓冲剂的豆腐，含有重量比为0.1-20％的缓冲剂的巧克力，含有重量比为0.1-20％的缓冲剂的米制甜食，含有重量比为0.1-20％的缓冲剂的中国汤团，和含有重量比为0.1-20％的缓冲剂的火腿。
本文使用的术语“口腔组合物”是指不同于食物和饮料的任何组合物，该组合物能引入口腔并能与牙齿接触。口腔组合物可以是药物或准药品或其它化合物。例如，该“口腔组合物”进一步包括化妆品(更具体地说，具有预防龋齿、增白牙齿、除去齿斑、清洁口腔、预防口臭、除去焦油、预防牙垢沉积等作用的洁牙剂(它是在日本药物法Japanese Pharmaceutical Affairs Law(2001年修订)下承认的化妆品)。具体而言，本发明的口腔组合物包括，例如，洁牙剂、嗽口剂、糖锭、含漱液、牙龈按摩膏、锭剂、人工唾液等。
在一个较佳的实施例中，本发明的口腔组合物是较佳地含有重量比为0.01-20％、更佳地重量比为0.02-10％、甚至更佳地重量比为0.03-5％，和特别优选地重量比为0.05-3％的缓冲剂的洁牙剂。
在一个较佳的实施例中，本发明的口腔组合物是较佳地含有重量比为0.01-20％、更佳地重量比为0.02-10％、甚至更佳地重量比为0.03-5％，和特别优选地重量比为0.05-3％的缓冲剂的嗽口药。
在一个较佳的实施例中，本发明的口腔组合物是较佳地含有重量比为0.01-20％、更佳地重量比为0.02-10％、甚至更佳地重量比为0.03-5％，和特别优选地重量比为0.05-3％的缓冲剂的口腔软膏。
优选地，本发明的口腔组合物是含有重量比为0.01-20％的缓冲剂的洁牙剂、漱口药、糖锭、含漱液、人工唾液等。
已使用人工唾液改善口干燥症。该人工唾液含有与人唾液基本上相同的组分，例如矿物质。含有上述缓冲剂的人工唾液不仅能湿润舌和喉粘膜使舌和喉粘膜平滑移动，还能预防和治疗龋齿。
本发明的膳食组合物和口腔组合物还任选地含有氟。本发明的膳食组合物和口腔组合物包含在1000ppm或更少，较佳地0.1-500ppm和更佳地0.1-300ppm的范围内。为了提高100ppm或更多的氟的效能，缓冲剂适用于药物、准药物和化妆品。本发明的膳食和口腔组合物可通过进一步含有氟而具有较高水平的牙齿补充矿质的效果。这里，“氟”包括氟离子。术语“含氟的物质”是指提供氟离子的任何物质，较佳地含有氟离子的化合物(例如，单氟磷酸钠、氟化钠、氟化钾、氟化铵、胺盐氟化物、和氟化锡)。较佳地使用单氟磷酸钠和氟化钠。
仅使用氟或含氟的物质导致低水平的牙齿补充矿质。特别是，氟和含氟的物质在100ppm或更高的浓度可能不溶解，导致效能明显下降。然而，在本发明中，发现缓冲剂与氟或含氟的物质一起使用导致效能的提高。对于食物，含有大量氟(200-300ppm)的茶等是优选的。氟或含氟的物质掺入牙齿晶体以产生抗酸的坚固晶体。因此，本发明的膳食组合物和口腔组合物涉及坚固的牙齿晶体的生产以及牙齿补充矿质，从而减少龋齿的产生。
本发明的膳食组合物和口腔组合物可进一步包含本领域熟练的技术人员已知的具有抗龋齿功能的其它物质。这种物质的例子包括各种寡糖(潘糖(62-葡糖基-麦芽糖)、异麦芽低聚糖、异蔗糖(6-O-α-葡糖吡喃糖基-D-呋喃果糖)、海藻糖(O-α-D-葡糖吡喃糖基(1-1)-α-D-吡喃葡萄糖苷)、麦芽低聚糖、乳蔗糖TM(4G-β-D-半乳糖基蔗糖)、呋喃低聚糖、偶联糖、木糖基果糖苷、环糊精等)；糖醇(木糖醇、赤藻糖醇、palatinit、山梨醇、麦芽糖醇、甘露醇等)；茶叶提取物(氟、多酚、儿茶素等)；草药(例如薄荷、薄荷油、春黄菊、鼠尾草、姜、迭迭香等，见Shibuya等，香料杂志特刊FRAGRANCEJOURNAL SPECIAL ISSUE，12，150-155页，1992)；酶(例如，葡聚糖酶、变位酶等)；和疫苗(例如分泌的抗变异链球菌的免疫球蛋白A)。糖醇是优选的。木糖醇是更优选的。本发明的膳食组合物和口腔组合物通过含有上述物质可具有预防龋齿的增强效果。
可使用已知的方法检测缓冲剂的补充矿质的效果，例如一个使用牛牙齿切片的补充矿质的试验系统，它描述于Inaba.D等，Eur.J.Sci.10574-80，1997；Inaba.D等，J.Dent.Health.4767-74，1997；和Iijima.Y等，Dental Caries Research.33206-213，1999。
为了测定包含于本发明的膳食组合物和口腔组合物中的缓冲剂的补充矿质的效果，本发明的发明者开发了与上述补充矿质试验系统相比较简单的试验系统。例如，补充矿质容易发生的条件如下向牙齿表面(羟磷灰石)的接触表面快速提供钙和磷，并将它们掺入牙齿成分(羟磷灰石)；在包括牙齿表面的系统中保持较高的钙和磷浓度；除牙齿表面外的区域没有钙和磷的沉积或流失。如下简化这些用于容易补充矿质的条件在包括羟磷灰石的系统中提供用于结晶的钙和磷并减少可溶的钙；和在不包括羟磷灰石的系统中，磷和钙不沉积并保持其较高的溶解度。因此，比较这两个系统中钙的溶解度的大小以检测补充矿质的效果。这些简单的试验系统将在下文中描述。TMR(横向显微放射显影术)方法作为一种用于以定量的方式测定牙质矿物质浓度的分布的标准方法已用于大量的对脱矿质和补充矿质的研究。对于这种方法，有如下限制需要长时间进行评估；需要高水平的试验技术等。因此，需要一个能够迅速捕获牙质矿物质浓度变化的简单的评价系统。通过如下两个步骤考虑开发在牙齿釉质的早期龋齿损伤中补充矿质(i)将釉质的组分钙(Ca)离子和磷(P)离子提供给脱矿质的部分；和(ii)提供的Ca离子和P离子用于脱矿质的部分中釉质的晶体生长。
鉴于上述两个步骤，一种具有促进补充矿质作用的物质被认为是一种在中性pH下抑制Ca和P的不溶解和沉淀但不抑制羟磷灰石的晶体生长的物质。
这些试验系统与上述使用牛牙齿的常规系统有关，并建立了一个简单和极好的方法。
在本发明的一个方面，本发明涉及研究预期具有抗龋齿作用的样品对牙齿补充矿质的效果的方法。该方法包括如下步骤(A)在有样品的情况下，在含有磷、钙以及牙齿成分的溶液中沉淀钙；(B)沉淀后测定溶液中钙的浓度或沉淀的钙的量；(C)在不含样品的溶液中沉淀钙；(D)沉淀后测定溶液中钙的浓度或沉淀的钙的量；和(E)比较步骤(B)和(D)中钙的浓度或沉淀的钙的量。在一个较佳的实施例中，上述溶液可包含羟磷灰石、缓冲液、K2HPO4和CaCl2。包含于上述溶液的“牙齿成分”是由于补充矿质，沉淀磷和钙以产生羟磷灰石的任何物质。羟磷灰石的使用是优选的。另外，可使用如牛等哺乳动物的牙齿、和其切片或分馏物。当制备用于钙沉淀的溶液时，添加上述磷、钙和其它牙齿成分的次序没有限制。较佳地，以如下次序添加以制备溶液，首先是样品，然后是磷、氯化钙溶液，和牙齿成分悬浮液或去离子水。较佳地，添加K2HPO4后调整溶液的pH。一般通过在室温下培育十几个小时到几天产生钙沉淀(较佳地10小时到7天，更佳地18小时到42小时)。可使用本领域熟练的技术人员已知的任何方法测定溶液的钙溶解度。溶液的钙溶解度可通过OCPC方法测定(使用由Wako Pure Chemicals生产的“Calcium Ctest Wako”)。另外，可测定溶液中沉淀的钙的量。可使用本领域熟练的技术人员已知的任何方法测定溶液中沉淀的钙的量。溶液的钙溶解度可使用本领域熟练的技术人员已知的任何方法测定。这种方法的例子包括ICP方法(诱导性偶联的等离子体方法)、原子吸收分析和离子电极方法。
为了测定抗龋齿的功能，一种人造口腔设备用于获得尽可能真实的脱矿质的釉质(见例如Jpn.J.Oral Biol.20288-291，1984)。例如，该设备可包含一个电极、附着在电极周围的釉质切片、和变异链球菌细胞悬浮液、培养液、和滴下糖溶液的工具。使用这种设备，合成不溶于水的葡聚糖的变异链球菌附着在电极表面形成一个人工空斑，从而产生低的pH。而且，一个人工空斑相似地在釉质部分上形成，导致釉质硬度的显著下降。
(实施例)下文中，将以实施例的方式详细描述本发明。这些实施例不是要限制本发明。用于实施例的材料、试剂等除非另外提及均为商业购得。
(实施例1)实施例1显示了生产用于本发明组合物的磷酸化寡糖的方法。
首先，当1％的马铃薯淀粉溶液溶解于含有6mM氯化钠和2mM的氯化钙的5ml溶液中时迅速加热到100℃以凝胶化。此后，使35U的由Hankyu Bioindustry Ltd.生产的α-淀粉酶(Fukutamirase)作用于凝胶化的混合物，并在50℃保持30分钟。少量的反应液用于制备0.2％的糖溶液。1/10份的0.01M的碘-碘化钾溶液加入一份的糖溶液中。在碘量滴定法中证实产生的混合物是阴性的。此后，同时使2U的支链淀粉酶(由Hayashibara Biochemical Lab.生产)和6U的葡糖淀粉酶(由Toyobo Co.，Ltd.生产)在40℃作用于混合物20小时。终止反应，随后离心。将上清液应用于用20mM乙酸盐缓冲液(pH 4.5)平衡的阴离子交换树脂柱(Chitopearl BCW 2501；由FujiSpinning Co.，Ltd生产)。该柱用乙酸盐缓冲液彻底洗涤以除去中性糖类，随后用含有0.5M氯化钠的乙酸盐缓冲液洗提。各个洗提的部分用蒸发器浓缩、脱盐、并冻干，由此获得磷酸化寡糖。
这样获得的磷酸化寡糖再次用于用20mM乙酸盐缓冲液(pH 4.5)平衡的阴离子交换树脂柱(Chitopearl BCW 2501)。该柱用乙酸盐缓冲液彻底洗涤以除去中性糖类。使该柱用含有0.15M氯化钠的乙酸盐缓冲液和然后用含有0.5M氯化钠的乙酸盐缓冲液洗提。收集的部分脱盐并冻干。根据上文提到的用于确定结构的方法分析这些部分，表明在从0.15M氯化钠洗提的部分中(PO-1部分)获得的磷酸化糖中，一个磷酸基团与具有含α-1，4键的3-5个葡萄糖的葡聚糖结合；并在从0.5M氯化钠洗提的部分中(PO-2部分)获得的磷酸化糖中，两个或更多的磷酸基团与具有含α-1，4键的2-8个葡萄糖的葡聚糖结合。
上述磷酸化寡糖的结构分析如下进行。
首先，从磷酸化寡糖中除去磷酸基团。100μl、3％磷酸化寡糖溶液与100μl含有10mM氯化镁、0.3mM氯化锌、和0.05％叠氮钠的60mM碳酸钠缓冲液(pH 9.4)混合。100μl、30U/ml碱性磷酸酶(EC.3.1.3.1；衍生自大肠杆菌由SIGMA生产)加入混合物，然后使之在40℃反应18小时。通过使用超滤膜除去碱性磷酸酶终止反应，由此获得含有已除去磷酸基团的糖(下文称为脱磷酸糖)的反应液(下文中称为反应液A)。
向10μl得到的反应液A加入溶解于10μl的200mM乙酸盐缓冲液(pH 4.8)的5000U/ml的β-淀粉酶(产生自甘薯；由SIGMA生产)，得到的混合物在37℃保留2小时(得到的液体称为反应液B)。相似地，溶解于10μl的60mM乙酸盐缓冲液(pH 4.5)的300U/ml的糖淀粉酶(衍生自根霉菌属；由Totobo Co.，Ltd.生产)加入10μl的反应液A，得到的混合物在35℃保留18小时(下文中得到的液体称为反应液C)。
分析反应液A-C以证实其中的产物。通过使用阴离子交换树脂柱，CarboPacPA-100(Ф4×250mm，由Dionex Corp.生产)的高效液相色谱或使用硅胶的薄层层析分析这些液体证实这些反应液中的产物，并将分析结果与具有各种聚合度的标准麦芽低聚糖的产物作比较。使用高效液相色谱洗提脱磷酸糖通过使用100mM氢氧化钠作为基础溶液，提高1M的乙酸钠的浓度进行。脱磷酸糖的检测使用脉冲电流检测器(由Dionex Corp.生产)进行。使用薄层层析分析脱磷酸糖可通过用乙腈/水(80/20)多重展开脱磷酸糖，喷洒硫酸/甲醇溶液(＝1/1)，并在130℃保留3分钟进行。
分析反应液A，以便确定磷酸化寡糖的链长。当分析反应液B时，只检测到麦芽糖和麦芽三糖(和少量的葡萄糖)。因此，证实脱磷酸糖是葡聚糖，其中葡萄糖通过α-1，4键互相连接。而且，当分析反应液C时，仅检测到葡萄糖。因此证实脱磷酸糖是由α-键连接的葡萄糖组成。
糖的平均链长(下文中，由DP代表，使用葡萄糖作为一个单位)从具有各种聚合度的脱磷酸糖类的糖含量获得。整个磷酸化糖类的总糖含量使用苯酚-硫酸方法测定。连接的磷酸基团的数量作为通过使脱磷酸糖类湿灰化(与淀粉相关的糖类试验方法，《生化试验方法》(Biochemistry experimental method)19，M.Nakamura等，31页，1986，JSSP Tokyo)获得的无机磷酸确定。根据如下公式，使用脱磷酸糖类湿灰化后确定的无机磷酸的量和DP计算每分子结合的磷酸基团的数量(每分子结合的磷酸基团的平均数量)＝ (实施例2)含有每分子具有一个磷酸基团的磷酸化寡糖的PO-1部分和含有每分子具有两个磷酸基团的磷酸化寡糖的PO-2部分各10g溶解于100ml的蒸馏水中。使用电透析仪(Micro acilyzer)G3、AC210-400膜由Asahi Kasei Co.，Ltd生产)除去这些水溶液中的盐分，然后使用强阳离子交换树脂(Dowex 50w 20-50MESH，H-型由NisshinKasei生产)进行离子交换，由此获得pH2.7的糖溶液。用1N氢氧化钠或氢氧化钙溶液中和得到的溶液，随后冻干，由此制得磷酸化寡糖钠盐或钙盐。
在下面的实施例中使用的磷酸化糖类(以钠盐或钙盐的形式)是含有80％或更多的上述PO-1部分的磷酸化糖和PO-2部分的磷酸化糖的剩余物的磷酸化糖类混合物。
(实施例3)在实施例3中，使用牛牙齿断片的系统用于澄清磷酸化寡糖对于早期龋齿补充矿质的作用。
该试验的进行基本上根据Inaba.D等，Eur.J.Sci.10574-80，1997；Inaba.D等，J.Dent.Helth.4767-74，1997；和Iijima.Y等，Caries Research.33206-213，1999。
在试验中使用的牙齿断片如下制备放置每边3mm的立方的牛牙齿断片以便其釉质表面向上。除釉质表面外用合成树脂覆盖断片。用湿的研磨砂纸处理釉质。脱矿质如下进行牙齿断片在37℃浸没于含有6％羧甲基纤维素凝胶的1％乳酸凝胶(pH5.0)中3周。补充矿质如下进行在37℃，脱矿质的牙齿断片浸没于含有1.5mMCaCl2和0.9mM KH2PO4的20mM 2-[4-(2-羟乙基)]-1-哌嗪乙磺酸盐(HEPES)缓冲液(pH7.0)中一周。
制备如下8个试验组(1)仅脱矿质(空白；图1和2中的“空白”)；(2)仅补充矿质(阴性对照；图1和2中的“对照”)；(3)补充矿质溶液+2ppm氟(F)(阳性对照；图1和2中的“2ppm F”)；(4)补充矿质溶液+4.0％磷酸化寡糖钠盐(图1和2中的“POsNa 4％”)；(5)补充矿质溶液+1.0％磷酸化寡糖钠盐(图1和2中的“POs Na 1％”)；(6)补充矿质溶液+0.2％磷酸化寡糖钠盐(图1和2中的“POs Na 0.2％”)；(7)补充矿质溶液+0.2％磷酸化寡糖钙盐(图1和2中的“POs Ca 0.2％”)；和(8)补充矿质溶液+0.07％磷酸化寡糖钙盐(图1和2中的“POs Ca 0.07％”)。
经过各个处理后，从各个处理的牙齿断片中制备200μm厚的切片，从显微放射照相的图象(未显示)分析其矿物质浓度的分布。当牙齿断片被脱矿质时，矿物质从牙齿断片洗脱并流失，其中依次产生空腔(龋齿发作)。图1显示根据该矿物质浓度分析矿物质流失值的图(垂直轴表明矿物质流失值)。图2显示脱矿质的深度[垂直轴表明损伤深度(μm)]。根据图1，对于磷酸化寡糖钠和磷酸化寡糖钙，在测试浓度的最低浓度水平上，矿物质损失最少。该矿物质损失少于(2)阳性对照的损失。就磷酸化寡糖钠和磷酸化寡糖钙来说，得到浅的损伤深度(图2)。这表明空腔通过补充矿质而填充。有趣的是，关于具有氟的(2)阳性对照，损伤深度没有改变。
经过各个处理后，还分析了补充矿质后的溶液中钙和磷浓度。溶液在10,000g离心2分钟，并分析上清液。使用钼酸方法测定磷浓度(“Shin-ban Bunseki KagakuJikken《新版分析化学实验》(New Edition Analyical Chemistry Experiment)(第一版)，313-314页，由Kagaku Dojin K.K.出版)，并用OCPC方法(由Wako Pure Chemicals生产使用“calcium C test Wako”试剂盒测定)测定钙浓度。结果显示于表1中。
表1Pi(mM) Ca(mM)对照 0.34 0.682ppm F0.41 0.73POs Na4％ 1.43.861％ 1.21.860.2％1.11.63POs Ca0.2％1.22.660.07％ 1.21.80
根据表1，发现通过加入磷酸化寡糖，溶解于溶液中的钙和磷的浓度仍高。
因此，钙试验表明通过加入磷酸化寡糖，溶解于溶液中的钙和磷的浓度仍高，结果，这些溶解的磷和钙可提供给龋齿部分并用于补充矿质。这种现象被认为发生在人的口腔中。
(实施例4)在实施例4中，一种补充矿质的简单试验系统用于澄清磷酸化寡糖对早期龋齿补充矿质的作用。
(补充矿质试验系统的步骤)为了以更加简单的方式检测补充矿质现象，更容易地产生补充矿质的条件被简化。在一个包含羟磷灰石的系统中，供给钙和磷用于结晶且可溶的钙被减少。相反，在一个不包含羟磷灰石的系统中，钙和磷不沉淀，以致其溶解度保持在高水平。基于这些事实，设计如下试验系统。
通过以如下次序混合下列物质制备500μl的溶液(1)50μl的200mM HEPES缓冲液(pH 7.0)；(2)200μl的去离子水或样品；(3)50μl的18mM KH2PO4溶液；(4)50μl的30mM氯化钙溶液；和(5)羟磷灰石悬浮液(5mg/ml)或去离子水。加入(3)后，使用0.1N氢氧化钾溶液调节溶液的pH。搅拌得到的溶液并在37℃培育1-7天。此后，溶液在12,000rpm离心3分钟。得到的上清液的钙浓度使用OCPC方法测定(如上述)。为此，使用Calcium test C Wako(编号272-21801)在570-nm处测定吸光度。可溶钙的百分比通过用加入的钙的浓度除以上清液的钙浓度乘以100获得。通过计算由去离子水获得的值和在(5)中加入羟磷灰石时得到的值之间的差数获得补充矿质的百分比。
(具有各种浓度的磷酸化寡糖对补充矿质的影响)上述简单试验系统用于在37℃培育具有各种浓度的磷酸化寡糖钠盐和磷酸化寡糖钙盐18小时或42小时。磷酸化寡糖钠盐和磷酸化寡糖钙盐补充矿质的结果分别显示于图3和4中(在图3和4中，垂直轴表示补充矿质的比率(％)，水平轴表示样品(％)，对照表示未加入样品；对于各个样品浓度，左边的条表示18小时处理，右边的条表示42小时处理)。磷酸化寡糖钠盐即使在低浓度下也改进了溶解加入的钙的能力(图3)。磷酸化寡糖钙盐具有低的溶解外部加入的钙盐的能力，并相反地释放额外的钙以改变溶液中的钙/磷比，以致于钙更容易沉淀并因此不能保持高的钙浓度(图4)。
因此，磷酸化寡糖钠盐能显示溶解作用而不改变系统中的钙/磷比。就磷酸化寡糖钙盐来说，认为需要与磷(磷酸盐、磷化合物等)同时供给以保持Ca/P比为1.67(P/Ca比＝0.6)。另外，加入的磷酸化寡糖钙盐的浓度需要对比值几乎没有影响。
(Ca/P浓度比＝1.67(P/Ca浓度比＝0.6)的磷酸化寡糖对补充矿质作用的影响)当使用磷酸化寡糖钙盐时，钙与磷浓度的比设定为1.67(P/Ca浓度比＝0.6)，设定浓度以从磷酸化寡糖中获得钙。设定钠盐以与磷酸化寡糖的浓度相匹配。浓度设定显示于以下表2中。
表2对照 POs Na
POs Ca
在上述简单试验系统中，37℃培育15小时。结果显示于图5中(垂直轴表示补充矿质的比率(％)，水平轴表示Ca浓度(mM)，填充的方形代表不含磷酸化寡糖盐的对照，菱形代表磷酸化寡糖钠盐(POs Na)，圆形代表磷酸化寡糖钙盐(POs Ca))。如图5所示，当Ca/P浓度比＝1.67(P/Ca浓度比＝0.6)不变且加入的钙的浓度提高时，在磷酸化寡糖钠盐和磷酸化寡糖钙盐之间获得相似的结果。当加入的钙盐是6mM或更多时，添加的磷酸化寡糖的作用降低。
(各种Ca/P比的磷酸化寡糖对补充矿质作用的影响)上述简单试验系统在37℃培养17.5小时或1周，期间钙与磷浓度比的改变显示于表3中(表3使用P/Ca)。
表3
该结果显示于图6A到6C中(垂直轴表示补充矿质的比率(％)，水平轴表示P/Ca)。图6A显示了不含磷酸化寡糖的对照的结果。方形代表17.5小时的处理，填充的菱形代表一周处理。图6B显示磷酸化寡糖钠盐的结果。三角形代表17.5小时处理，填充的三角形代表一周处理。图6C显示磷酸化寡糖钠盐的结果。圆形代表17.5小时处理，填充的圆形代表一周处理。如图6A到6C所示，当Ca固定到1.5mM并且磷浓度变化而改变P/Ca比时，认为磷酸化寡糖钠盐和磷酸化钙盐引起相对有效地补充矿质。根据这一结果，认为即使在高浓度磷的情况下，钙盐更加稳定。
(实施例5)实施例5显示磷酸化寡糖与其它抗龋齿药剂在补充矿质作用中的比较。作为抗龋齿的药剂，使用木糖、木糖醇、异蔗糖和palatinit。使用实施例3的简单系统检测补充矿质的效果。在该简单系统中，37℃培育8天。结果显示于图7A到7C中(垂直轴表示补充矿质的比率(％)，水平轴表示样品浓度(％))。图7A显示磷酸化寡糖盐的结果，其中填充的三角形代表钙盐，空的三角形代表钠盐。图7B显示木糖醇的结果，其中填充的圆形代表木糖醇，空的圆形代表木糖。图7C显示palatinit的结果，其中填充的方形代表palatinit，空的方形代表异蔗糖。根据图7A到7C，浓度低至约0.1％磷酸化寡糖显示了高的补充矿质的效果，而其它抗龋齿的药剂(木糖醇、异蔗糖、和palatinit)如以前所报道的，在浓度为20％时显示补充矿质的作用(日本公开出版物2000-128752号，日本公开出版物2000-247852号等)。对于木糖，在任何浓度补充矿质的百分比都低。
(实施例6)在实施例6中检测了磷酸化寡糖抑制脱矿化的效果。
制备具有如下组分的脱矿化溶液6.0mM氯化钙溶液；3.6mM磷酸二氢钾；2％乳酸盐溶液；和5mg/ml羟磷灰石溶液，pH 5.0。125μl的脱矿化溶液和125μl的具有终浓度为0.2％和2％磷酸化寡糖钠盐溶液混合并搅拌，随后在37℃培育2天。此后，混合物在12,000rpm离心3分钟。使用OCPC方法测定得到的上清液的钙浓度。加入的钙浓度和处理后钙的浓度。如果在有检测样品的情况下，加入的钙浓度和处理后钙的浓度之间的差异与对照(不含检测的样品)相比小，认为检测样品具有抑制脱矿化的作用。与不含磷酸化寡糖的对照(5mM)相比，0.2％和2％磷酸化寡糖钠盐溶液具有小的差异(3mM和2mM)。因此，认为磷酸化寡糖钠盐具有抑制脱矿化的作用。
(实施例7)实施例7显示了磷酸化寡糖与氟对于补充矿质作用的协同影响。
下面表4中描述的组合物用于检测在磷酸化寡糖存在或不存在的情况下补充矿质的效果。
表4
实施例中的简单系统用于检测补充矿质的效果。在简单系统中在37℃培育5天。此后，使用OCPC方法测定可溶钙的量。通过薄层层析(TLC)定性地证实磷酸化寡糖。用于TLC分析的条件如下硅胶平板(由Merck生产)；乙醇/去离子水/乙酸(＝70/30/2)；在室温展开一次；加入5μl的样品；1μl的1％磷酸化寡糖和1μl的1％的麦芽三糖作为标记。
TLC分析的结果显示于表8中。在图8中，各个泳道显示具有各种浓度(ppm)的氟，上方的点代表麦芽三糖，下方的点代表磷酸化寡糖。图9显示磷酸化寡糖与氟对补充矿质效果的协同作用(垂直轴表示补充矿质的比率(％)，水平轴表示氟的浓度(ppm)；在各个值中，左边的条表示不含磷酸化寡糖的对照，右边的条属于0.2％磷酸化寡糖的组)。氟是高度活泼的卤素。检测了氟对磷酸化寡糖和钙的定量的作用。在试验条件下，氟加入的影响似乎是微不足道的(图8)。氟的加入改变了Ga/P的浓度比的平衡，以致不溶解性下降。因此，由于氟浓度的提高补充矿质的比率下降。然而，当加入0.2％磷酸化寡糖钠盐时，补充矿质的效果趋于提高，因此，可证实显著的协同作用(图9)。
(实施例8)实施例8显示与口香糖混合的磷酸化寡糖以及进入人口腔的磷酸化寡糖的洗提。
制备显示于表5中的含有磷酸化寡糖钙盐的片状口香糖(平板样口香糖)(钙含量是3.2％)(片状口香糖具有约3.2g的重量)。
表5
3.2g/片状口香糖当咀嚼口香糖时，随时间洗提进入口腔的钙盐的量通过薄层层析(TLC)分析。用于TLC的条件如下展开平板是一个硅胶平板；展开洗提液是乙醇/去离子水/乙酸＝70/30/2；展开温度是室温，展开进行一次；点样的量是3μl；通过向平板喷洒检测溶液(硫酸/乙醇＝1∶1)进行检测，随后在130℃处理3分钟，借此点显出颜色。
图10显示具有标准溶液浓度的磷酸化寡糖的TLC分析结果。各个泳道显示具有各种浓度的磷酸化寡糖的洗提(表示左边为1％木糖醇作为对照和右边为1％麦芽三糖(G3))。下方的点代表磷酸化寡糖，上方的点代表木糖醇和麦芽三糖。图11显示当咀嚼含磷酸化寡糖的口香糖时随时间的洗提量。各泳通表示随咀嚼时间的洗提(表示左边为1％磷酸化寡糖作为对照，右边为1％木糖醇和麦芽三糖(G3)。下方的点代表磷酸化寡糖，上方的点代表木糖醇和麦芽三糖。磷酸化寡糖没有用唾液淀粉酶水解。根据这些图，将理解咀嚼开始后约10分钟，相对高浓度的磷酸化寡糖存在于口腔中，20分钟后，磷酸化寡糖保留约0.25％浓度。
(实施例9)实施例9显示磷酸化寡糖对蔗糖发酵的影响。
变异链球菌菌株8148在37℃培养于1,000ml的脑心浸液培养基(由DIFCOCorporation生产)14小时。此后，通过在6,000rpm离心20分钟收集细菌。细菌用磷酸缓冲盐溶液(PBS，pH 7.2)洗涤，并于相同的PBS中悬浮至40％(v/v)。为了测定pH，反应混合物(250μl)由125μl的40％细菌细胞悬浮液、62.5μl的80mM蔗糖和62.5μl的含有各种寡糖的水溶液(5％磷酸化寡糖钠盐和磷酸化寡糖钙盐)组成。在37℃培养时，反应混合物的pH用pH仪(由Toa Denpa生产)连续测定。
当0.684％蔗糖或0.684％葡萄糖加入含有变异链球菌8158菌株的20％细菌细胞悬浮液，5分钟内反应液的pH下降至5.0以下，10分钟后下降至4.0。当5％磷酸化寡糖(PO-1和PO-2)同时存在时，在两种情况下pH的下降被明显抑制(数据未显示)。当加入5％磷酸化寡糖钠盐或磷酸化寡糖钙盐时，由于0.684％的蔗糖的发酵引起的pH下降被有效抑制(数据未显示)。
(实施例10)在实施例10中，制备磷酸化寡糖的糖醇。
10g含有每分子具有一个磷酸基团的磷酸化寡糖的PO-1部分和具有2个磷酸基团的磷酸化寡糖的PO-2部分溶解于100ml的蒸馏水中。用1N氢氧化钠溶液将溶液调整为弱碱溶液(约pH 8)。向100ml获得的溶液加入30ml的3％氢氧化硼钠溶液。使混合物在40℃放置1小时以使磷酸化寡糖还原。这样，氢被加入磷酸化寡糖的还原末端。用1N盐酸溶液调节加入氢的溶液到pH 7.5。反应终止后，溶液使用0.22μm膜进行透析。获得的溶液使用电透析仪(Micro acilyser)G3，AC210-400膜由AsahiKasei Corporation生产)脱盐，然后使用强阳离子交换树脂(Dowex 50w 20-50 MESH，H-型由Nisshin Kasei生产)进行离子交换，由此获得pH 2.7的糖溶液。获得的溶液用1N氢氧化钠溶液或氢氧化钙溶液中和，随后冻干，从而制备磷酸化寡糖钠或钙盐。
(实施例11)在实施例11中，制备硫酸软骨素寡糖(不饱和双糖(二聚体))。
4.8g的硫酸软骨素钠(C型由Katayama Kagaku生产)溶解于500ml的蒸馏水中(pH 6.0)。15U软骨素酶ACII(衍生自金黄节杆菌，由Seikagaku Kogyo生产)加入得到的溶液并使之在37℃反应23小时。在沸水浴中终止反应，随后如实施例10中所描述的脱盐。这样，制备了硫酸软骨素寡糖钠或钙盐。
(实施例12)在实施例12中，检测了各种物质的补充矿质的作用。
使用实施例4的简单补充矿质试验系统。关于样品，使用显示于以下表6中的物质。制备所有物质为0.1％的终浓度。
表6编号 样品1POs Na2PO-2 Na3POsH Na4G35PO-2H Na6Glc-6-P7Ser-P8硫酸软骨素C9低聚半乳糖醛酸10 二聚体Na11 D.W.
在上述表6中，编号1的POs Na表示磷酸化寡糖(PO-1部分)钠盐，编号2的PO-2Na表示磷酸化寡糖(PO-2部分)钠盐，编号3的POsH Na表示磷酸化寡糖(PO-1部分)糖醇钠盐，编号4的PO-2H Na表示磷酸化寡糖(PO-2部分)糖醇钠盐，编号5的G3表示麦芽三糖(葡萄糖三糖)，编号6的Glc-6-P表示葡萄糖-6-磷酸，编号7的Ser-P表示磷酸丝氨酸，编号8表示硫酸软骨素C，编号9表示低聚半乳糖醛酸，编号10表示硫酸软骨素的不饱和双糖(在表6和图12中，二聚体钠)，和编号11的D.W.表示去离子水。
结果显示于图12中(垂直轴表示补充矿质的比率(％)，水平轴表示样品物质)。图中，具有比去离子水补充矿质的比率高的物质被判定具有补充矿质的作用。磷酸化寡糖醇钠盐、葡萄糖-6-磷酸、硫酸软骨素C钠盐，和硫酸软骨素不饱和双糖钠盐显示补充矿质的作用，其作用与磷酸化寡糖钠盐一样好或优于磷酸化寡糖钠盐。
(实施例13)在实施例13中，检测了各种物质的补充矿质的作用。
使用实施例4的简单补充矿质试验系统。关于样品，使用显示于表7中的物质。
表7
表7中，编号1的POs Na表示磷酸化寡糖(PO-1部分)钠盐(0.2％的终浓度)，编号2的POs Na表示磷酸化寡糖(PO-1部分)钠盐(2.0％的终浓度)，编号3表示异蔗糖(20％的终浓度)，编号4表示异蔗糖(20％的终浓度，编号5表示木糖醇(Wako 244-0052)(2.0％的终浓度)，编号6表示木糖醇(Wako 244-0052)(20％的终浓度)，编号7表示海藻糖(Wako 02252)(2％的终浓度)，编号8表示海藻糖(Wako 02252)(20％的终浓度)，编号9表示山梨醇(Katayama 28-4770)(2％的终浓度)，编号10表示山梨醇(Katayama 28-4770)(20％的终浓度)，编号11的G3表示麦芽三糖(2％的终浓度)，编号12的D.W.表示去离子水(对照)，编号13表示有机酸(酒石酸)(2％的终浓度)，编号14表示有机酸(酒石酸)(1.4％的终浓度)，和编号15表示硫酸葡聚糖(0.2％的终浓度)。
结果显示于图13中(垂直轴表示补充矿质比率(％)，水平轴表示样品物质)。在包括木糖醇、异蔗糖、和山梨醇的20％添加组中，证实补充矿质的作用与以前报道的一致(如上述)。而且，与硫酸软骨素相似，证实硫酸皮肤素具有补充矿质的作用。有机酸与磷酸化寡糖相似也是有效的。
(实施例14)在实施例14中，在人工口腔装置中检测预防龋齿的效果。
表兄链球菌菌株6715培养物(预培养于脑心浸液培养基(由DIFCO Corporation生产))，心浸液培养基(由DIFCO Corporation生产)，和样品溶液(各个样品在检测过程中冷却)，以6ml/小时/管的速度分别提供给保存于恒温浴(37℃)的牛牙齿(约5×5mm)。随时间测定牙齿表面的pH。结果显示于图14中(垂直轴表示pH的改变，水平轴表示时滞；圆形代表添加仅1％糖(GF)，填充的三角形代表添加1％GF+5％磷酸化寡糖钙盐(POs Ca))。16小时后，齿斑从牙齿上刮去，在500nm处测定浑浊度。而且，通过苯酚-硫酸方法测定形成的水不溶的葡聚糖(WIG)的量。使用硬度计测定牙齿的硬度。得到此硬度与未处理的牙齿的硬度之间的差值(ΔH)。结果显示于表8中。
表8
很明显在1％GF(糖)的情况下，产生有机酸，约10分钟后，pH为5.6或更少，该有机酸保持在齿斑中。齿斑充分地形成，牙齿遭受脱矿质并变脆。相反，在含有1％GF和5％磷酸化寡糖的溶液中，没有形成齿斑，并且pH没有降低。即，防止了龋齿细菌侵入牙齿，以致于齿斑形成受到阻抑，并抑制了牙齿的脱矿化。因此，牙齿的硬度没有改变。根据这一结果，清楚地发现磷酸化寡糖具有预防龋齿的作用。认为这一现象类似地发生于人的口腔中。
(实施例15)在实施例15中，从各种淀粉中制备磷酸化寡糖。
用于本实施例的淀粉取自水稻、淀粉(品牌名称Better FriendTM由ShimadaKagaku生产)和木薯淀粉(Sanwa Cornstarch Co.，Ltd.)。
100g的淀粉粉末加入800-1000ml水中。向得到的溶液中加入50μl衍生自细菌地衣芽孢杆菌(购自Fukutamirase，来自Hankyu Industries，1％)的5000U/ml的淀粉液化α-淀粉酶(BLA)。该溶液在50℃水浴中凝胶化48小时。另外，50μl的5000U/mlBLA(Fukutamirase，来自Hankyu Industries，1％)、50μl的200U/ml支链淀粉酶(Promozyme由Novo Nordisk生产)、和50μl的葡糖淀粉酶(416U/ml)(购自Toyobo)加入到凝胶化的淀粉中，随后在50℃培养48小时。获得的混合物在8,000rpm离心20分钟。将上清液应用于用10mM乙酸盐缓冲液(pH 4.5)平衡的阴离子交换树脂(Chitopearl BCW 2501由Fuji Spinning Co.，Ltd.生产)。用相同的缓冲液彻底洗涤柱以除去中性糖类，随后用含有0.5M氯化钠的相同缓冲液洗提。各个洗提的部分用蒸发器浓缩，随后去盐和冻干。由此获得磷酸化寡糖。
这样获得的磷酸化寡糖再次用于由20mM乙酸盐缓冲液(pH 4.5)平衡的阴离子交换树脂柱(Chitopearl BCW2501)。用相同的缓冲液彻底洗涤柱以除去中性糖类。首先用含有0.15M氯化钠的相同缓冲液洗提柱，接着用含有0.5M氯化钠的相同缓冲液洗提，由此收集部分。收集到的部分去盐并冻干。根据上述用于确定结构的方法分析这些部分，表明在从0.15m氯化钠洗提的部分(PO-1部分)获得的磷酸化寡糖中，一个磷酸基团与含α-1，4键的3-5个葡萄糖的葡聚糖连接；在从用0.5M氯化钠洗提的部分(PO-2部分)中获得的磷酸化寡糖中，两个或更多的磷酸基团与含α-1，4键的2-8个葡萄糖的葡聚糖结合。磷酸化寡糖的结构分析如实施例1中描述的进行。
(实施例16)实施例16显示含有磷酸化寡糖的口香糖具有促进早期龋齿中釉质补充矿质的作用。
用通常使用的方法生产两种片状口香糖(约1.5g/片)含有衍生自马铃薯淀粉的2.5％(平均含量)的POs Ca的无糖口香糖(含有45％的木糖醇)和不含POs Ca的无糖口香糖(含有47.5％的木糖醇)。所有的试验试剂都是保证试剂。各个物质的含量是关于口香糖总重量的比例。
关于牙齿材料，使用牛牙齿的冠釉质。使用菱形锯(由LUXO生产)将釉质切成具有标准大小侧面的块(7×7×3mm)。这些釉质块(6个样品)包埋于自聚的树脂，(UNIFAST Trad，由GC生产)，形成具有大小为15×50mm和厚度为7mm的平板。此后，用湿润的研磨砂纸(粒度800)研磨平板的表面以暴露出平坦而新鲜的釉质。另一方面，牙齿的牙质侧预先包埋于印模膏(由GC生产)。每一个这样制备的釉质块包埋平板在37℃浸没于100ml的0.1M乳酸凝胶(6wt％羧甲基纤维素，pH 5.0)4周，由此人为地产生龋齿。
17名健康的受检者参加了一项测试，测试中受检者咀嚼两种含有POs Ca的口香糖或不含POs Ca的口香糖颗粒(3.0g)20分钟。测试中，没有告知受检者口香糖的种类。在口香糖咀嚼开始后到1分钟后、1分钟后到3分钟后、3分钟后到6分钟后、6分钟后到10分钟后，以及10分钟后到20分钟后的时间阶段中，使用塑料漏斗从受检者收集唾液到10ml的塑料试管中。收集后立即测定唾液的量和pH。其后，用蒸馏水稀释唾液上清液10倍，随后用0.45μm滤器(由Millipore生产)过滤。使用OCPC方法(Calcium Ctest Wako；由Wake Pure Chemicals生产)和钼酸方法定量滤液中Ca和无机P的含量。
12名健康的受检者参加了一项测试，测试中受检者咀嚼两种片状的含POs Ca的口香糖或不含POs Ca的口香糖(3.0g)20分钟。测试中，没有告知受检者口香糖的种类。使用塑料漏斗从受检者收集在20分钟咀嚼的第一个10分钟的过程中(唾液A)和第二个10分钟的过程中(唾液B)的唾液放入50ml塑料试管中。收集后立即测定唾液的量和pH。测定后，立即将7ml的唾液倾入塑料容器(10×30×60mm)中，在该容器中事先放置一个具有人造龋齿的包釉质块包埋平板。此量为釉质块包埋平板可充分浸没于唾液中的量。平板浸没于唾液A中10分钟后，该平板浸没于唾液B中10分钟。此后，移去平板，用蒸馏水彻底洗涤平板表面。该浸没操作是在37℃进行，并一天连续重复4次。操作后釉质块包埋平板日常保存于湿度为100％的凉爽环境中。使用每天收集的人唾液连续4天进行测试。对于测试中使用的唾液，使用上清液的部分并用蒸馏水稀释10倍，随后用0.45μm滤器(由Millipore生产)过滤。使用上述方法每天测定滤液的Ca和无机P。
在人的唾液中浸没后，使用坚硬组织切割器(Isomet，Buhler，USA)将各个牙齿釉质切割成为具有约500μm厚度的切片。用湿润的研磨砂纸(粒度800)研磨各个切片到约200μm厚度。各个切片进行显微放射照相(PW-1830，Philips，荷兰)。用于显微放射照相的条件是管电压为25kv；电流是25mA；管和受检者之间的距离是370mm。此后，使用Inaba等的图象定量方法(Eur.J.Oral.Sci.10574-84，1997)测定损伤深度(Ld，μm)和矿物质流失值ΔZ(体积％·μm)。
17名健康的受检者咀嚼2种含POs Ca的口香糖或不含POs Ca的口香糖颗粒(3.0g)20分钟。在这种情况下，唾液的量(图15水平轴代表口香糖咀嚼时间垂直轴代表唾液量(ml))、唾液的pH(图16水平轴代表口香糖咀嚼时间，垂直轴代表pH)、唾液中Ca含量(图18水平轴代表口香糖咀嚼时间，垂直轴代表Ca量(mg))，和唾液中P含量(图17水平轴代表口香糖咀嚼时间，垂直轴代表磷量(mg))随时间而测定，其中数值从开始由整合值表示。而且，计算唾液的Ca/P比的变化(图19水平轴代表口香糖咀嚼时间，垂直轴代表Ca/P比)。在各个图中，含POs Ca的口香糖(+POs Ca口香糖)和不含POs Ca的口香糖(-POs Ca口香糖)分别由方形和菱形表示。
结果，分泌的唾液的量(图15)、pH变化(图16)和P含量的变化(图17)在口香糖类型中没有改变到统计学上的显著水平。在20分钟的口香糖咀嚼中，分泌约30ml的唾液，5分钟后唾液的pH从开始咀嚼口香糖时的7.0提高到7.5。通过口香糖咀嚼分泌的唾液中P的含量约5mg，与钙含量相比它足以用于补充矿质。相反，清楚地发现在含有POs Ca的口香糖的情况下，咀嚼开始20分钟后溶解于唾液中的Ca量约4倍于咀嚼不含POs Ca的口香糖的情况(图18)。由于一定量的P本来存在于唾液中(图16)，在含有POs Ca的口香糖情况下，Ca/P比也明显高(p＜0.001)(图19)。在上述分析结果中，在女性和男性受检者之间没有发现明显差异。
图9显示了从咀嚼两种含有POs Ca的口香糖或不含POs Ca的口香糖颗粒(3.0g)20分钟的12名健康受检者中收集的唾液A和唾液B的分析结果。
表9唾液体积、pH和矿物质含量的比较口香糖种类 唾液A 唾液B唾液(ml) +POs Ca 20.34±4.139.35±3.24-POs Ca 20.74±4.439.65±3.35Ca(mM)+POs Ca 6.2±2.44**1.72±0.53*-POs Ca 1.69±0.41 1.51±0.42P(mM) +POs Ca 5.62±1.41 6.22±1.31-POs Ca 6.15±1.35 6.49±1.15Ca/P +POs Ca 1.12±0.31**0.28±0.08-POs Ca 0.28±0.08 0.23±0.06平均值±标准差，*p＜0.05，**p＜0.001，n＝12在两种口香糖中，唾液A的量约两倍于唾液B的量。在唾液A中，不含POs Ca的口香糖和含有POs Ca的口香糖之间Ca含量有明显差异。然而，在唾液B中，这种差异。对于P含量，在两种口香糖之间以及在唾液A和B之间没有鉴别到差异。因此，在唾液A中，当咀嚼含有POs Ca的口香糖时，其Ca/P比约4倍于当咀嚼不含POs Ca的口香糖时的Ca/P比。
接着，对于12个受检者的被处理牙齿的补充矿质促进效果的评估结果以损伤深度和矿物质流失值显示于图20A(垂直轴表示损伤深度(Ld，μm))和图20B(垂直轴表示矿物质流失值ΔZ(v％·μm))。在两个图中，水平轴以空白、含有POs Ca的口香糖、和不含POs Ca的口香糖的次序表示。根据损伤深度(Ld)和矿物质流失值(ΔZ)，观察到在含有POs Ca的口香糖的情况下比不含POs Ca的口香糖的情况下脱矿质的牙齿釉质的恢复明显。即，在含有POs Ca的口香糖的咀嚼组中，获得了补充矿质的促进效果(p＜0.001)。
(实施例17)实施例17显示在人的口腔中，含有磷酸化寡糖的口香糖对釉质的补充矿质的促进效果。
与实施例13相似，制备了两种片状的口香糖(约1.5g/片)，即含有POs Ca口香糖和不含POs Ca无糖口香糖。所有使用的试验试剂是保证试剂。
从牛切牙的齿冠部的釉质部分制备釉质片(直径5mm；厚度1.5mm)。颊面的头部表面用湿润的研磨砂纸(粒度800)磨光以暴露出新鲜而平刨的釉质。这样制备的釉质片在37℃浸没于100ml的0.1M乳酸溶液(pH 5.0)3天以产生人造龋齿。脱矿质后，三个釉质片附着在一个可移动的腭板的上部右侧磨牙的腭区。
12名健康的受检者(6名男性和6名女性；平均年龄＝21岁)一次咀嚼2片含有POsCa的口香糖、不含POs Ca的口香糖，或蔗糖口香糖(含62％的蔗糖)(1粒约1.5g)20分钟。在这一测试中，每个受检者咀嚼其中的一种口香糖一天4次。没有告知负责该测试的人以及受检者正在咀嚼的口香糖的类型。对于每一种口香糖，该测试一直进行2周。在各个测试之间有一周的间隔时间。在口香糖咀嚼的过程中或之后，腭板被附着20分钟。在测试期间，受检者没有使用氟剂并且分离的腭板在100％湿度下储存，避免干燥。
1、2和4周后，测试的附着的牙齿从各个受检者的腭板上除去。从各个釉质上切厚度约为200μm的切片。各个切片进行显微放射照相(PW-1830，Philips，荷兰)。显微放射照相的条件如下管电压25kV；管电流25mA；管和受检者之间的距离为370mm。此后，用Inaba等的图象定量方法测定损伤深度(ld，μm)(Eur.J.Oral.Sci.10574-84，1997)。Ld的值根据矿物质分布图作为从牙齿头部表面到损伤位置之间的距离而确定，在损伤的位置中矿物质含量达到健康组织矿物质含量的95％水平。补充矿质的比率计算为与脱矿质后初始ld值有关的ld值的缩减比。补充矿质的结果显示于图21。在图21中，水平轴以周1、周2和周4的次序表示蔗糖口香糖组(Suc)，不含POs Ca的口香糖组(Xyl)，和含有POs Ca的口香糖组(POs)。垂直轴表示补充矿质的比率(％)。
在含有POs Ca的口香糖组(POs)中，周1、周2和周4时补充矿质的比率分别为67％、54％和76％。不含POs Ca的口香糖组(Xyl)是12到23％，该值低于含有POsCa的口香糖组。蔗糖口香糖组(Suc)截止到周2显示正的补充矿质的比率，而截止到周4最终达到负值，表明脱矿质。
人的口腔内评估显示在含有POs Ca的口香糖的情况下比在不含POs Ca的口香糖和蔗糖口香糖的情况下具有较高的补充矿质促进效果。具体地说，所有的12名受检者咀嚼各种口香糖各两周并在含有POs Ca的口香糖的情况下获得显著的结果。因此，通过人的口腔内评估证实向口香糖中加入POs Ca导致高水平的补充矿质促进效果。同时，在口腔中还证实通过在基本上每天的基础上食用含有POs Ca的口香糖产品，增强早期龋齿补充矿质的作用，因此非常有效地预防龋齿。
(实施例18)在实施例18中，分析了当摄入含有磷酸化寡糖的糖果时唾液的成分。
制备含有如图10中描述的成分的糖果。
表10糖果 (％按重量计)Palatinit 95POs Ca 2.94调味剂 2.064个健康的成人受检者食用糖果(4.7g)并收集分泌的唾液。糖果放入口中后在口腔中停留约10分钟。在如下4个时间段收集唾液(i)0-1分钟；(ii)1-3分钟；(iii)3-6分钟；和(iv)6-10分钟。通过漏斗收集分泌的唾液进入15ml的试管。收集后，立即搅拌分泌的唾液，并测定唾液的pH和含量。结果显示于图22和23中。在图22中，水平轴表示摄入时间(min)，垂直轴表示pH。口腔中唾液的pH恒定为7。图23中，水平轴表示摄入时间(min)，垂直轴表示唾液的量(ml/min)。分泌的唾液的量在摄入时间过程中基本上恒定。
而后，1800μl的唾液放入4个离心管中。200μl的1N HCl溶液加入各个管中。混合液充分混合，随后在10,000xg离心3分钟，并使之通过0.5μm膜。用OCPC方法测定10μl获得的上清液以确定钙含量。使用钼方法测定50μl的上清液以确定磷含量。钙和磷含量显示于图24中。在图24中，水平轴表示摄入时间(min)，左边的垂直轴表示钙或磷含量(mM)，右边的垂直轴表示Ca/P比。在摄入时间过程中，钙和磷含量基本恒定(保持在约0.6)。
(实施例19)实施例19中，制备含有磷酸化寡糖的糖果和软糖以确定补充矿质促进效果。
依据通常使用的方法制备表11中所显示的含有这些成分的糖果(4.7g/粒)和软糖(4.0g/粒)。
表11糖果(％按重量计)Palatinit 95POs-Ca 2.94调味剂 2.06软糖(％按重量计)Palatinit 47.5木糖醇 47.5POs-Ca 2.94调味剂 2.0610ml蒸馏水加入各个上述糖果或软糖中，并在沸水浴中溶解。使用微型pH仪测定得到的提取溶液的pH。此后，提取溶液在10,000xg离心3分钟并通过0.5μm膜。用OCPC方法测定10μl获得的上清液以确定钙浓度。使用钒钼酸方法测定50μl的上清液溶液以确定无机磷浓度。结果显示于表12中。
表12软糖和糖果的提取物中Ca和P的矿物质含量产物Ca(mM) P(mM) Ca/P软糖3.88 1.822.13糖果5.18 2.142.42而且，基于表12的结果分析，调整2倍和10倍稀释的提取液具有钙和磷的含量显示于表13中。此后，评估对羟磷灰石的补充矿质促进效果。
表13用于促进补充矿质作用的评估系统3.0mM CaCl2溶液1.8mM KH2PO4溶液20mM HEPES缓冲液(pH 7.0)(0.5mg/ml羟磷灰石)结果显示于图24中。在图24中，水平轴表示摄入时间(min)，左边的垂直轴表示钙或磷含量(mM)，右边的垂直轴表示Ca/P比。
在糖果或软糖中，10倍稀释的溶液显示了高水平的补充矿质促进效果。
(实施例20)用通常使用的方法制备含有显示于表14中的组合物的洁牙剂。
表14
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例21)用通常使用的方法制备含有显示于表15中的组合物的洁牙剂。
表15
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例22)用通常使用的方法制备含有显示于表16中的组合物的洁牙剂。
表16
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例23)用通常使用的方法制备含有显示于表17中的组合物的洁牙剂。
表17
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例24)用通常使用的方法制备含有显示于表18中的组合物的洁牙剂。
表18
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例25)用通常使用的方法制备含有显示于表19中的组合物的洁牙剂。
表19
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例26)用通常使用的方法制备含有显示于表20中的组合物的洁牙剂。
表20
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例27)用通常使用的方法制备含有显示于表21中的组合物的洁牙剂。除1N氢氧化锌溶液用于中和外，POs Zn以与实施例2中相同的方式制备。
表21
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例28)用通常使用的方法制备含有显示于表22中的组合物的洁牙剂。
表22
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例29)用通常使用的方法制备含有显示于表23中的组合物的漱口剂。
表23
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例30)用通常使用的方法制备含有显示于表24中的组合物的漱口剂。
表24
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例31)用通常使用的方法制备含有显示于表25中的组合物的漱口剂。
表25
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例32)用通常使用的方法制备含有显示于表26中的组合物的漱口剂。
表26
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例33)用通常使用的方法制备含有显示于表27中的组合物的漱口剂。除1N氢氧化锌溶液用于中和外，POs Zn以与实施例2中相同的方式制备。
表27
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例34)用通常使用的方法制备含有显示于表28中的组合物的口腔软膏。
表28
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例35)用通常使用的方法制备含有显示于表29中的组合物的口腔软膏。
表29
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例36)用通常使用的方法制备含有显示于表30中的组合物的洁牙剂。
表30
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例37)用通常使用的方法制备含有显示于表31中的组合物的洁牙剂。
表31
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例38)用通常使用的方法制备含有显示于表32中的组合物的洁牙剂。
表32
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例39)用通常使用的方法制备含有显示于表32中的组合物的洁牙剂。
表33
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例40)用通常使用的方法制备含有显示于表34中的组合物的洁牙剂。
表34
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例41)用通常使用的方法制备含有显示于表35中的组合物的洁牙剂。
表35
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例42)用通常使用的方法制备含有显示于表36中的组合物的洁牙剂。
表36
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例43)用通常使用的方法制备含有显示于表37中的组合物的洁牙剂。
表37
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例44)用通常使用的方法制备含有显示于表38中的组合物的洁牙剂。
表38
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例45)用通常使用的方法制备含有显示于表39中的组合物的漱口剂。
表39
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例46)用通常使用的方法制备含有显示于表40中的组合物的漱口剂。
表40
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例47)用通常使用的方法制备含有显示于表41中的组合物的漱口剂。
表41
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例48)用通常使用的方法制备含有显示于表42中的组合物的漱口剂。
表42
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例49)用通常使用的方法制备含有显示于表43中的组合物的漱口剂。
表43
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例50)用通常使用的方法制备含有显示于表44中的组合物的口腔软膏。
表44
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例51)用通常使用的方法制备含有显示于表45中的组合物的口腔软膏。
表45
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例52)用通常使用的方法制备含有显示于表46中的组合物的洁牙剂。
表46
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例53)用通常使用的方法制备含有显示于表47中的组合物的洁牙剂。
表47
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例54)用通常使用的方法制备含有显示于表48中的组合物的洁牙剂。
表48
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例55)用通常使用的方法制备含有显示于表49中的组合物的洁牙剂。
表49
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例56)用通常使用的方法制备含有显示于表50中的组合物的洁牙剂。
表50
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例57)用通常使用的方法制备含有显示于表51中的组合物的洁牙剂。
表51
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例58)用通常使用的方法制备含有显示于表52中的组合物的洁牙剂。
表52
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例59)用通常使用的方法制备含有显示于表53中的组合物的洁牙剂。
表53
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例60)用通常使用的方法制备含有显示于表54中的组合物的洁牙剂。
表54
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例61)用通常使用的方法制备含有显示于表55中的组合物的漱口剂。
表55
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例62)用通常使用的方法制备含有显示于表56中的组合物的漱口剂。
表56
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例63)用通常使用的方法制备含有显示于表57中的组合物的漱口剂。
表57
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例64)用通常使用的方法制备含有显示于表58中的组合物的漱口剂。
表58
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例65)用通常使用的方法制备含有显示于表59中的组合物的漱口剂。
表59
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例66)用通常使用的方法制备含有显示于表60中的组合物的口腔软膏。
表60
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例67)用通常使用的方法制备含有显示于表61中的组合物的口腔软膏。
表61
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例68)用通常使用的方法制备含有显示于表62中的组合物的洁牙剂。
表62
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例69)用通常使用的方法制备含有显示于表63中的组合物的洁牙剂。
表63
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例70)用通常使用的方法制备含有显示于表64中的组合物的洁牙剂。
表64
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例71)用通常使用的方法制备含有显示于表65中的组合物的洁牙剂。
表65
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例72)用通常使用的方法制备含有显示于表66中的组合物的洁牙剂。
表66
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例73)用通常使用的方法制备含有显示于表67中的组合物的洁牙剂。
表67
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例74)用通常使用的方法制备含有显示于表68中的组合物的洁牙剂。
表68
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例75)用通常使用的方法制备含有显示于表69中的组合物的洁牙剂。
表69
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例76)
用通常使用的方法制备含有显示于表70中的组合物的洁牙剂。
表70
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例77)用通常使用的方法制备含有显示于表71中的组合物的漱口剂。
表71
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例78)用通常使用的方法制备含有显示于表72中的组合物的漱口剂。
表72
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例79)用通常使用的方法制备含有显示于表73中的组合物的漱口剂。
表73
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例80)用通常使用的方法制备含有显示于表74中的组合物的漱口剂。
表74
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例81)用通常使用的方法制备含有显示于表75中的组合物的漱口剂。
表75
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例82)用通常使用的方法制备含有显示于表76中的组合物的口腔软膏。
表76
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例83)用通常使用的方法制备含有显示于表77中的组合物的口腔软膏。
表77
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例84)用通常使用的方法制备含有显示于表78中的组合物的洁牙剂。
表78
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例85)用通常使用的方法制备含有显示于表79中的组合物的洁牙剂。
表79
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例86)用通常使用的方法制备含有显示于表80中的组合物的洁牙剂。
表80
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例87)用通常使用的方法制备含有显示于表81中的组合物的洁牙剂。
表81
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例88)用通常使用的方法制备含有显示于表82中的组合物的洁牙剂。
表82
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例89)用通常使用的方法制备含有显示于表83中的组合物的洁牙剂。
表83
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例90)用通常使用的方法制备含有显示于表84中的组合物的洁牙剂。
表84
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例91)用通常使用的方法制备含有显示于表85中的组合物的洁牙剂。
表85
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例92)用通常使用的方法制备含有显示于表86中的组合物的洁牙剂。
表86
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例93)用通常使用的方法制备含有显示于表87中的组合物的漱口剂。
表87
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例94)用通常使用的方法制备含有显示于表88中的组合物的漱口剂。
表88
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例95)用通常使用的方法制备含有显示于表89中的组合物的漱口剂。
表89
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例96)用通常使用的方法制备含有显示于表90中的组合物的漱口剂。
表90
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例97)用通常使用的方法制备含有显示于表91中的组合物的漱口剂。
表91
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例98)用通常使用的方法制备含有显示于表92中的组合物的口腔软膏。
表92
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例99)用通常使用的方法制备含有显示于表93中的组合物的口腔软膏。
表93
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例100)用通常使用的方法制备含有显示于表94中的组合物的洁牙剂。
表94
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例101)用通常使用的方法制备含有显示于表95中的组合物的洁牙剂。
表95
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例102)用通常使用的方法制备含有显示于表96中的组合物的洁牙剂。
表96
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例103)用通常使用的方法制备含有显示于表97中的组合物的洁牙剂。
表97
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例104)用通常使用的方法制备含有显示于表98中的组合物的洁牙剂。
表98
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例105)用通常使用的方法制备含有显示于表99中的组合物的洁牙剂。
表99
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例106)用通常使用的方法制备含有显示于表100中的组合物的洁牙剂。
表100
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例107)用通常使用的方法制备含有显示于表101中的组合物的洁牙剂。
表101
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例108)用通常使用的方法制备含有显示于表102中的组合物的洁牙剂。
表102
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例109)用通常使用的方法制备含有显示于表103中的组合物的漱口剂。
表103
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例110)用通常使用的方法制备含有显示于表104中的组合物的漱口剂。
表104
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例111)用通常使用的方法制备含有显示于表105中的组合物的漱口剂。
表105
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例112)用通常使用的方法制备含有显示于表106中的组合物的漱口剂。
表106
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例113)用通常使用的方法制备含有显示于表107中的组合物的漱口剂。
表107
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例114)用通常使用的方法制备含有显示于表108中的组合物的口腔软膏。
表108
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例115)用通常使用的方法制备含有显示于表109中的组合物的口腔软膏。
表109
使用这种组合物可获得满意的抗龋齿功能。
(实施例116)用通常使用的方法制备含有显示于表110中的组合物的人造唾液。
表110(mg)氯化钠 42.2氯化钾 60氯化钙 7.3氯化镁 2.6磷酸二氢钾 17.1POs Ca 20总量(ml) 50该人造唾液具有极好的补充矿质促进效果和使口腔中的pH恢复到中性的能力。
(实施例117)用通常使用的方法制备含有显示于表111中的组合物的人造唾液。
表111(mg)氯化钠 42.2氯化钾 60POs Ca 10氯化镁 2.6磷酸二氢钾 17.1总量(ml) 50该人造唾液具有极好的补充矿质促进效果和使口腔中的pH恢复到中性的能力。
人造唾液可类似地通过加入除POs Ca和POs Na外的缓冲剂制备。
工业适用性如上所述，本发明提供了通过牙齿补充矿质等减少龋齿的发生的膳食组合物和口腔组合物。
权利要求
1.一种具有抗龋齿功能的膳食组合物，其特征在于，所述组合物包括在口腔中具有pH缓冲作用的缓冲剂。
2.如权利要求1所述的膳食组合物，其特征在于，所述缓冲剂是磷酸化寡糖或其糖醇。
3.如权利要求1所述的膳食组合物，其特征在于，所述缓冲剂选自磷酸化寡糖或其糖醇，其中磷酸化寡糖是由具有α-1，4键的3-5个葡萄糖组成的葡聚糖，其中一个磷酸基团与葡聚糖连接，或是由具有α-1，4键的2-8个葡萄糖组成的葡聚糖，其中两个磷酸基团与葡聚糖连接；硫酸软骨素；硫酸软骨素寡糖；葡萄糖-6-磷酸；寡半乳糖醛酸；和酒石酸。
4.如权利要求1所述的膳食组合物，其特征在于，所述缓冲剂是磷酸化寡糖或其糖醇，其中磷酸化寡糖是由具有α-1，4键的3-5个葡萄糖组成的葡聚糖，其中一个磷酸基团与葡聚糖连接，或是由具有α-1，4键的2-8个葡萄糖组成的葡聚糖，其中两个磷酸基团与葡聚糖连接。
5.如权利要求1所述的膳食组合物，其特征在于，所述缓冲剂是呈碱金属盐、碱土金属盐、或铁盐的形式。
6.如权利要求5所述的膳食组合物，其特征在于，所述缓冲剂是呈钠盐或钙盐的形式。
7.如权利要求1所述的膳食组合物，其特征在于，所述组合物进一步包含有效量的氟或用于抗龋齿的含氟物质。
8.一种具有抗龋齿功能的膳食组合物，其特征在于，所述组合物包含在口腔中具有pH缓冲作用的缓冲剂、磷-钙补偿剂、磷制剂、和/或钙制剂。
9.如权利要求8所述的膳食组合物，其特征在于，所述缓冲剂是磷酸化寡糖或其糖醇。
10.如权利要求8所述的膳食组合物，其特征在于，所述缓冲剂选自磷酸化寡糖或其糖醇，其中磷酸化寡糖是由具有α-1，4键的3-5个葡萄糖组成的葡聚糖，其中一个磷酸基团与葡聚糖连接，或是由具有α-1，4键的2-8个葡萄糖组成的葡聚糖，其中两个磷酸基团与葡聚糖连接；硫酸软骨素；硫酸软骨素寡糖；葡萄糖-6-磷酸；寡半乳糖醛酸；和酒石酸。
11.如权利要求8所述的膳食组合物，其特征在于，所述缓冲剂是磷酸化寡糖或其糖醇，其中磷酸化寡糖是由具有α-1，4键的3-5个葡萄糖组成的葡聚糖，其中一个磷酸基团与葡聚糖连接，或是由具有α-1，4键的2-8个葡萄糖组成的葡聚糖，其中两个磷酸基团与葡聚糖连接。
12.如权利要求8所述的膳食组合物，其特征在于，所述缓冲剂是呈碱金属盐、碱土金属盐、或铁盐的形式。
13.如权利要求12所述的膳食组合物，其特征在于，所述缓冲剂是呈钠盐或钙盐的形式。
14.如权利要求8所述的膳食组合物，其特征在于，所述组合物进一步包含有效量的氟或用于抗龋齿的含氟物质。
15.一种具有抗龋齿功能的口腔组合物，其特征在于，所述组合物包括在口腔中具有pH缓冲作用的缓冲剂。
16.如权利要求15所述的口腔组合物，其特征在于，所述缓冲剂是磷酸化寡糖或其糖醇。
17.如权利要求15所述的口腔组合物，其特征在于，所述缓冲剂选自磷酸化寡糖或其糖醇，其中磷酸化寡糖是由具有α-1，4键的3-5个葡萄糖组成的葡聚糖，其中一个磷酸基团与葡聚糖连接，或是由具有α-1，4键的2-8个葡萄糖组成的葡聚糖，其中两个磷酸基团与葡聚糖连接；硫酸软骨素；硫酸软骨素寡糖；葡萄糖-6-磷酸；寡半乳糖醛酸；和酒石酸。
18.如权利要求15所述的口腔组合物，其特征在于，所述缓冲剂是磷酸化寡糖或其糖醇，其中磷酸化寡糖是由具有α-1，4键的3-5个葡萄糖组成的葡聚糖，其中一个磷酸基团与葡聚糖连接，或是由具有α-1，4键的2-8个葡萄糖组成的葡聚糖，其中两个磷酸基团与葡聚糖连接。
19.如权利要求15所述的口腔组合物，其特征在于，所述缓冲剂是呈碱金属盐、碱土金属盐、锌盐或铁盐的形式。
20.如权利要求19所述的口腔组合物，其特征在于，所述缓冲剂是呈钠盐、钙盐、或锌盐的形式。
21.如权利要求15所述的口腔组合物，其特征在于，所述组合物进一步包含有效量的氟或用于抗龋齿的含氟物质。
22.如一种具有抗龋齿功能的口腔组合物，其特征在于，所述组合物包含在口腔中具有pH缓冲作用的缓冲剂、磷-钙补偿剂、磷制剂、和/或钙制剂。
23.如权利要求22所述的口腔组合物，其特征在于，所述缓冲剂是磷酸化寡糖或其糖醇。
24.如权利要求22所述的口腔组合物，其特征在于，所述缓冲剂选自磷酸化寡糖或其糖醇，其中磷酸化寡糖是由具有α-1，4键的3-5个葡萄糖组成的葡聚糖，其中一个磷酸基团与葡聚糖连接，或是由具有α-1，4键的2-8个葡萄糖组成的葡聚糖，其中两个磷酸基团与葡聚糖连接；硫酸软骨素；硫酸软骨素寡糖；葡萄糖-6-磷酸；寡半乳糖醛酸；和酒石酸。
25.如权利要求22所述的口腔组合物，其特征在于，所述缓冲剂是磷酸化寡糖或其糖醇，其中磷酸化寡糖是由具有α-1，4键的3-5个葡萄糖组成的葡聚糖，其中一个磷酸基团与葡聚糖连接，或是由具有α-1，4键的2-8个葡萄糖组成的葡聚糖，其中两个磷酸基团与葡聚糖连接。
26.如权利要求22所述的口腔组合物，其特征在于，所述缓冲剂是呈碱金属盐、碱土金属盐、锌盐或铁盐的形式。
27.如权利要求26所述的口腔组合物，其特征在于，所述缓冲剂是呈钠盐、钙盐、或锌盐的形式。
28.如权利要求22所述的口腔组合物，其特征在于，所述组合物进一步包含有效量的氟或用于抗龋齿的含氟物质。
29.一种用于研究预期对牙齿具有抗龋齿作用的样品的补充矿质效果的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤在样品存在的情况下，使含有磷、钙、和牙齿成分的溶液进行钙沉淀反应；沉淀反应后，测定溶液中钙的浓度或沉淀的钙的量；在不含样品的情况下，使溶液进行钙沉淀反应；沉淀反应后，测定溶液中钙的浓度或沉淀的钙的量；和比较步骤(B)和(D)中溶液中钙的浓度或沉淀的钙的量。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述溶液含有羟磷灰石、缓冲液、KH2PO4和CaCl2。
全文摘要
本发明涉及具有抗龋齿功能的膳食组合物和口腔组合物。本发明提供具有抗龋齿功能的膳食组合物和口腔组合物，该组合物包含在口腔中具有pH缓冲作用的缓冲剂。
文档编号A61K8/60GK1501774SQ02805648
公开日2004年6月2日 申请日期2002年2月28日 优先权日2001年2月28日
发明者釜阪宽, 西村隆久, 户尾健二, 栗木隆, 冈田茂孝, 阪本礼一郎, 木村敏幸, 鱼津伸夫, 一郎, 久, 二, 夫, 孝, 幸 申请人:江崎格力高株式会社
本文链接： http://nisshinkasei.immuno-online.com/view-716454.html
发布于 ： 2021-03-24
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